劉學(xué)雷，王云杰，楊寧愛，安童童，康宇婷，賈 偉，蘇雅靜，趙志軍

弓形蟲是一種專性的胞內(nèi)寄生蟲，能導(dǎo)致嚴(yán)重弓形蟲病，在世界的不同地理區(qū)域有大量的人口感染弓形蟲，在免疫抑制或者懷孕的婦女會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果,例如：流產(chǎn)、產(chǎn)后的畸形以及新生兒的死亡[1-2]。巨噬細(xì)胞是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要細(xì)胞模型，當(dāng)受到外界環(huán)境諸多病原體刺激時(shí)表型和功能會(huì)發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為巨噬細(xì)胞極化[3]。巨噬細(xì)胞極化主要分為M1型和M2型，M1型主要分泌促炎因子，M2型主要分泌抑制炎癥的因子[4-5]。弓形蟲作為一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，可侵入所有的哺乳動(dòng)物的有核細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是人體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，RH株弓形蟲感染后會(huì)引起巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞作為一種免疫細(xì)胞應(yīng)起到控制弓形蟲感染與增殖的作用，但是有文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道弓形蟲可感染大鼠的巨噬細(xì)胞并且在內(nèi)部增殖[6-7]。弓形蟲是否利用巨噬細(xì)胞極化而實(shí)現(xiàn)感染與增殖很值得我們探究。

本研究擬使用人單核細(xì)胞系THP-1經(jīng)佛波酯(PMA)誘導(dǎo)后分化為M0型巨噬細(xì)胞， M0型巨噬細(xì)胞表達(dá)的蛋白偏向M1型巨噬細(xì)胞，這種巨噬細(xì)胞模型在國內(nèi)外已經(jīng)應(yīng)用普遍，因此運(yùn)用THP-1的細(xì)胞模型來研究弓形蟲對(duì)巨噬細(xì)胞的極化是可行的[8-9]。通過Diff染色、Western blot、Q-PCR等方法研究弓形蟲感染THP-1細(xì)胞后極化相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)情況。探究弓形蟲RH株感染對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1材料 弓形蟲RH株為本實(shí)驗(yàn)室保存的；THP-1單核細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；佛波酯(PMA)購自索萊寶公司;胎牛血清購自BI公司；培養(yǎng)基1640購自GIBCO公司；Trizol購自ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo公司;熒光定量PCR試劑購自Roche公司；兔抗人誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)抗體、兔抗人精氨酸酶-1(Arginase-1)抗體、HPR標(biāo)記山羊抗兔IgG(IgG-HRP)購自Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞復(fù)蘇以后，37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，使用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，1∶3進(jìn)行傳代。

1.2.2THP-1細(xì)胞的誘導(dǎo) THP-1細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿細(xì)胞約4×106個(gè)。PMA的濃度保持在100 ng/mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞為貼壁的巨噬細(xì)胞。

1.2.3弓形蟲傳代 弓形蟲從液氮取出后于37 ℃水浴快速融化，取250 μL注入小鼠腹腔內(nèi)。當(dāng)小鼠出現(xiàn)蜷縮、背部毛發(fā)炸起、腹部膨脹后無痛斷頸處死小鼠。用酒精擦拭腹部皮膚，剪開長(zhǎng)約1 cm的腹部皮膚，吸取PBS注入小鼠腹腔內(nèi)輕柔腹部使PBS混勻，然后從中吸取100 μL注入健康小鼠腹腔內(nèi)完成第一次弓形蟲的傳代。傳代3次后弓形蟲毒力穩(wěn)定可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4THP-1細(xì)胞感染 弓形蟲傳到3代以后從第四代開始可用于感染。無痛斷頸處死發(fā)病小鼠，75%酒精擦拭腹部皮膚，眼科剪剪開長(zhǎng)約1 cm的腹部皮膚，注射PBS 5mL,輕柔腹部，混勻后抽出含有弓形蟲的PBS。1 000 r/min，離心5 min，棄上清，加1640沖懸混勻，計(jì)數(shù)。THP-1細(xì)胞與弓形蟲1∶1感染。未加弓形蟲的作為對(duì)照組，感染弓形蟲的設(shè)1 h、12 h、18 h、24 h、36 h組，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5細(xì)胞爬片與Diff染色 收集含有THP-1細(xì)胞懸液，800 r/min,離心5 min;棄上清，加2 mL 1640沖懸混勻，計(jì)數(shù)。細(xì)胞數(shù)為1×106/孔接種于6孔板內(nèi) 。每孔加10 μg/mL的 PMA 20 μL,使?jié)舛缺３衷?00 ng/mL。誘導(dǎo)48 h后感染弓形蟲。然后根據(jù)設(shè)的不同時(shí)間取出爬片，晾干，固定，Diff染液A液染30 s后PBS沖洗晾干，B液染15 s后去離子水沖洗晾干。

1.2.6LPS刺激THP-1細(xì)胞 THP-1細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿細(xì)胞約4×106個(gè)，THP-1經(jīng)PMA刺激48 h分化為巨噬細(xì)胞，LPS濃度分別為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、1000 ng/mL刺激巨噬細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，提取蛋白。Western blot法檢測(cè)iNOS和Arg-1表達(dá)情況。

1.2.7蛋白免疫印跡 Western blot法檢測(cè)THP-1細(xì)胞感染弓形蟲后iNOS和Arg-1蛋白的表達(dá)情況 收集長(zhǎng)在10 cm皿內(nèi)的對(duì)照組、1 h、12 h、18 h、24 h、36 h的細(xì)胞(種植、誘導(dǎo)，感染的方法同前),提取總蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白的濃度。進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)模、以及封閉，分別用兔抗人iNOS和Arg-1(1∶2 000)以及兔抗人β-actin抗體(1∶2 000)在4 ℃孵育過夜，二抗孵育(山羊抗兔多克隆IgG抗體，工作液1∶5 000)2 h，發(fā)光液顯色后，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.8極化相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的檢測(cè) 通過Trizol 法提取細(xì)胞的總 RNA，TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,通過 SYBR Green 熒光定量 PCR 測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中 iNOS 、 Arginase-1等 mRNA 水平表達(dá)情況。以 β-actin 作為內(nèi)參基因，相對(duì)定量使用的方法是 2-ΔΔCt。所用引物見表 1。

表1 本研究中所用到的引物序列Tab.1 Primer sequences used in this study

2 結(jié) 果

2.1弓形蟲體外感染THP-1巨噬細(xì)胞 采用Diff染色并在顯微鏡下觀察弓形蟲在細(xì)胞內(nèi)的增殖情況。THP-1細(xì)胞感染弓形蟲以后，1 h弓形蟲已經(jīng)進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，到18 h細(xì)胞內(nèi)的弓形蟲明顯增值且感染細(xì)胞的數(shù)量也增多。24 h感染細(xì)胞明顯增多且有少部分蟲體已破細(xì)胞而出，36 h細(xì)胞基本被破壞且蟲體都破細(xì)胞而出，僅有少數(shù)有細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞殘存(圖1)。

2.2極化相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) PMA誘導(dǎo)后感染弓形蟲以并收集 1 h、12 h、18 h、24 h、36 h蛋白。Western blot檢測(cè)蛋白的iNOS和Arg-1蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，隨著時(shí)間的增加iNOS逐漸減少，36 h表達(dá)量最低。Arg-1在對(duì)照組、1 h、12 h無表達(dá)，18 h有少量表達(dá)，36 h Arg-1表達(dá)量明顯高于其他組，同時(shí)檢測(cè)了不同濃度的LPS對(duì)巨噬細(xì)胞iNOS和Arg-1表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示Arg-1無表達(dá)，LPS濃度為100 ng/mL時(shí)iNOS的表達(dá)量最高(圖2、圖3)。

(A為經(jīng)PMA誘導(dǎo)后正常的巨噬細(xì)胞：B、C、D、E、F分別為感染弓形蟲1 h、12 h、16 h、24 h、36 h后的巨噬細(xì)胞。紅色箭頭指示弓形蟲)圖1 PMA誘導(dǎo)后在不同時(shí)間點(diǎn)感染弓形蟲的情況(Diff染色×1000)Fig.1 Toxoplasma gondii infection at different time points following PMA induction (Diff staining×1 000)

圖2 PMA誘導(dǎo)組在不同感染時(shí)間點(diǎn)下蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Protein expression level in PMA-induced group at different time points of infection

圖3 不同濃度LPS對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of different concentrations of LPS on protein expression

2.3極化相關(guān)因子 mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè) 檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)M1極化標(biāo)志因子IL-1、IL-12、TNF-α和iNOS mRNA以及M2極化標(biāo)志因子IL-10、TGF-β、MIP-1和Arg-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。PMA誘導(dǎo)并感染后M1極化相關(guān)因子隨著時(shí)間的與對(duì)照組相比逐漸降低，36 h表達(dá)量與對(duì)照組比較降低最明顯(t=3.313,P<0.05)。M2極化相關(guān)因子IL-10和Arg-1的表達(dá)量逐漸增加，到36 h表達(dá)量明顯高于其他組(t=9.587,P<0.05)。q-PCR和Werstern Blot的趨勢(shì)一致(圖4)。

3 討 論

根據(jù)弓形蟲對(duì)小鼠的致病力，將其分為高致病力(如Ⅰ型)和低致病力(Ⅱ型和Ⅲ型)蟲株[10]，不同蟲株感染宿主后引起的免疫反應(yīng)也會(huì)不同。研究表明弓形蟲巨噬細(xì)胞系，Ⅰ(RH株、SH株等)和Ⅲ型主要通過釋放棒狀體激酶ROP16激活STAT6信號(hào)通路，巨噬細(xì)胞向M2方向極化，Ⅱ(ME49、QH株等)型主要通過釋放致密顆?？乖璆RA15激活NF-κβ通路使巨噬細(xì)胞向M1方向極化[1, 11]。M1型巨噬細(xì)胞會(huì)釋放iNOS(一氧化氮合成酶)，M2型巨噬細(xì)胞則釋放Arg-1(精氨酸酶Ⅰ)。iNOS和Arg-1都可以利用精氨酸分別產(chǎn)生NO和尿素。NO對(duì)弓形蟲的生長(zhǎng)具有殺傷抑制作用，而弓形蟲可以利用尿素產(chǎn)生多胺類物質(zhì)為自身的增殖提供營養(yǎng)。iNOS和Arg-1分別作為M1和M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白。Zhao等人發(fā)現(xiàn)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞在感染弓形蟲RH株后，高表達(dá)Arg-1[12]。弓形蟲RH株在感染小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)蛋白Arg-1低表達(dá)，iNOS高表達(dá)[13]。

本實(shí)驗(yàn)用弓形蟲RH株感染經(jīng)人類THP-1巨噬細(xì)胞模型后發(fā)現(xiàn)，Arg-1的表達(dá)量在對(duì)照組和1 h和12 h時(shí)無表達(dá)，36 h表達(dá)量明顯高于其他時(shí)間點(diǎn)，而iNOS的表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)，36 h表達(dá)量明顯低于其他組。弓形蟲RH株通過分泌ROP16調(diào)控宿主與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的信號(hào)通路基因表達(dá)，使巨噬細(xì)胞向M2方向極化，減少iNOS的生成，降低NO對(duì)自身的抑制和殺傷作用，增加多胺類物質(zhì)的生成為弓形蟲增殖提供物質(zhì)條件。THP-1體外感染弓形蟲RH株，Diff染色的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)弓形蟲在1 h和12 h細(xì)胞內(nèi)的蟲體數(shù)量較少， 24 h細(xì)胞內(nèi)的蟲體數(shù)量明顯增多，36 h細(xì)胞大多數(shù)被破壞，弓形蟲破膜而出。

通過對(duì)相關(guān)mRNA表達(dá)量檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)分泌的IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子的表達(dá)量明顯降低，M2型巨噬細(xì)胞分泌的IL-10、MIP-1等促炎因子表達(dá)量逐漸增加。弓形蟲RH株感染后可以通過減少巨噬細(xì)胞IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生，降低炎癥對(duì)弓形蟲增殖的抑制作用。IL-12可刺激并且激活T細(xì)胞，促使Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，Th1細(xì)胞可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗感染免疫，特別是胞內(nèi)病原菌的感染。弓形蟲通過調(diào)控IL-12基因的低表達(dá)，使IL-12因子生成減少以此降低宿主細(xì)胞對(duì)弓形蟲的免疫殺傷作用。IL-10又稱細(xì)胞因子生成抑制因子(CSIF)，已有研究表明IL-10可以抑制TNF-α的生成從而在抑制炎癥的發(fā)生和免疫平衡方面發(fā)揮重要作用[14]。M2型巨噬細(xì)胞分泌的MIP-1作為參與組織損傷修復(fù)的因子在弓形蟲感染后表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，表明弓形蟲感染后會(huì)是巨噬細(xì)胞向M2型極化。有研究表明TGF-β可以起到抑制胞內(nèi)殺傷弓形蟲速殖子的作用[15]。TGF-β作為一種抑制炎癥發(fā)生和加強(qiáng)組織修復(fù)的因子，巨噬細(xì)胞感染弓形蟲以后發(fā)現(xiàn)1 h mRNA的表達(dá)量高于對(duì)照組，在感染早期弓形蟲會(huì)促進(jìn)TGF-β的高表達(dá)。Q-PCR的結(jié)果證明了弓形蟲RH株感染巨噬細(xì)胞后會(huì)抑制M1型相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，促進(jìn)M2型相關(guān)因子mRNA高表達(dá)。Q-PCR檢測(cè)iNOS和Arg-1 mRNA的表達(dá)量和WesternBlot結(jié)果一致。弓形蟲RH株會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向M2表型偏移。

在以往研究弓形蟲調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化中多采用大鼠或者小鼠的巨噬細(xì)胞系模型。本研究中采用佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞，并且成功獲得了有懸浮細(xì)胞分化為貼壁巨噬細(xì)胞的模型；采用THP-1誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞的模型對(duì)研究弓形蟲RH株對(duì)人巨噬細(xì)胞的極化調(diào)節(jié)具有重要意義；從弓形蟲調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的角度為弓形蟲病的防治提供一個(gè)前期研究基礎(chǔ)。