劉穎 劉鳳蘭

【摘 要】

目的：探討無(wú)添加的黑枸杞酵素面膜抗衰老活性及安全性評(píng)價(jià)。方法：通過(guò)DPPH自由基清除試驗(yàn)、羥自由基清除試驗(yàn)考察抗氧化性能、MTT法檢測(cè)成纖維細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定成纖維細(xì)胞凋亡率、家兔眼刺激試驗(yàn)進(jìn)行整體評(píng)價(jià)。結(jié)果：抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：黑枸杞酵素面膜具有很好的清除自由基作用，作用效果強(qiáng)于VE，且與劑量成正相關(guān)；細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明：黑枸杞酵素面膜對(duì)成纖維細(xì)胞具有很好的增殖作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)24 h 的皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率明顯降低。結(jié)論：由酵素制備的黑枸杞無(wú)添加面膜可作為化妝品進(jìn)行推廣和使用。

【關(guān)鍵詞】 黑枸杞；酵素；無(wú)添加；抗衰老

【中圖分類號(hào)】R285.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1005-0019（2018）21-187-01

黑枸杞屬于茄科枸杞屬，生長(zhǎng)環(huán)境使其具有極強(qiáng)的的耐寒、耐高溫、耐干旱力，古醫(yī)籍中具有益腎明目、補(bǔ)血寧神、生津止渴的功效，由于其含有豐富的微量元素、原花青素 、枸杞多糖 、甜菜堿、酸漿紅素、胡蘿卜素、維生素、亞油酸等，現(xiàn)代科學(xué)認(rèn)為其可提高肌膚細(xì)胞抗氧化、抗衰老、保濕、抗過(guò)敏及抗炎等能力[1] 。是化妝品珍貴的原料之一。但在有限的工藝條件下，其提取出的護(hù)膚活性成分含量較低。而采用生物發(fā)酵技術(shù)，過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性受到抑制，可降低其對(duì)膠原蛋白的裂解，從而能更好地保持黑枸杞的營(yíng)養(yǎng)成分。

本試驗(yàn)使用的即為采用生物發(fā)酵技術(shù)工藝制備的黑枸杞面膜，同時(shí)添加了具有抗衰老成分的銀耳、人參等成分，制備過(guò)程中堅(jiān)守天然無(wú)添加的原則，從而既保證了有效成分高提取率，高吸收率，又可防止防腐劑對(duì)機(jī)體造成的內(nèi)分泌紊亂、神經(jīng)系統(tǒng)傷害及產(chǎn)生的皮膚的過(guò)敏等毒性作用。以期為現(xiàn)代所倡導(dǎo)的綠色高科技的無(wú)添加化妝品制備提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 供試品 洋媽制嫩膚葆顏水潤(rùn)鮮膜，由廈門洋媽制生物科技有限公司制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗氧化試驗(yàn)

1.2.1.1 DPPH自由基清除試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[2]，稱取適量DPPH，用無(wú)水乙醇配制DPPH 溶液。將面膜液以85%的乙醇進(jìn)行等比稀釋，稀釋后相當(dāng)于質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2g/L的待測(cè)液，加入至96孔板中，另設(shè)空白對(duì)照組和維生素E陽(yáng)性對(duì)照組，再加入 150 μL 濃度為 0.1 mmol/L 的 DPPH 溶液，混合均勻，避光反應(yīng) 30 min，517 nm 波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度A 值，計(jì)算清除率。

1.2.1.2 羥基自由基清除試驗(yàn) 將面膜提液以85%的乙醇進(jìn)行等比稀釋，稀釋后相當(dāng)于質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0g/L的待測(cè)液，參照文獻(xiàn)[3]，在比色管中依次加入2.0 mL 9.0mmol/L的FeSO 4溶液、待測(cè)樣品和2.0 mL8.8mmol/L的過(guò)氧化氫溶液，混勻，靜置10 min，再加入 2.0 mL 6.0 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，振蕩器上混勻，置于37℃水浴鍋中，20 min后，離心8min，取上清液測(cè)定吸光度（A536nm），所得值為A1；設(shè)蒸餾水空白組，測(cè)得吸光度為A0；陰性組吸光度記A2。羥基自由基清除率計(jì)算公式為：（A1-A0） /（A2-A0） ×100%。另設(shè)維生素E為陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 組織塊貼壁法[4]體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞，用4-6代處于對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.2.2.2 供試品處理 精密稱取面膜液（無(wú)添加和添加防腐劑）各1ml，相當(dāng)于含有原料藥為0.1克，臨用時(shí)用含80ml/L的PBS的DMEM倍比稀釋成不同濃度的面膜稀釋液。使成濃度為50μg /ml、100μg /ml、200μg /ml的三個(gè)劑量組。

1.2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 分為7組：空白組；低、中、高供試品組；低、中、高加入防腐劑供試品組。

1.2.2.4 MTT法檢測(cè)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖 取胰酶消化培養(yǎng)的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，分別加入以上6個(gè)供試品溶液，置于96孔板，同時(shí)設(shè)不加藥物的空白對(duì)照組。每個(gè)質(zhì)量濃度及空白組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另做 1 孔不加細(xì)胞 ，只加培養(yǎng)液和中藥（比色時(shí)用此孔調(diào)零）。培養(yǎng) 24小時(shí)后取出，490nm下測(cè)定吸光值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)成纖維細(xì)胞凋亡率 細(xì)胞分為兩組，酵素面膜組，劑量為300μg /ml，另一組為相應(yīng)濃度的 DMSO（0. 01 %）作溶劑的對(duì)照組，將細(xì)胞接種于 6 孔板中，CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 家兔眼睛刺激試驗(yàn) 取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔4只，雌性，健康狀態(tài)下進(jìn)行試驗(yàn)，輕拉開(kāi)單側(cè)眼下眼瞼，取供試品0.1ml滴入結(jié)膜囊中，分別觀察12、24、48、72、96h及第7天的眼部反應(yīng)，按照化妝品的安全性評(píng)價(jià)程序規(guī)定的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行權(quán)重評(píng)級(jí)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 黑枸杞酵素面膜對(duì)DPPH具有很好的清除作用，且作用效果強(qiáng)于VE，且與劑量成正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到3.2g/L時(shí)，清除率可達(dá)67.5%。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.1.2 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，黑枸杞酵素面膜對(duì)羥自由基具有很好的清除作用，且作用效果強(qiáng)于VE，且與劑量成正相關(guān)，當(dāng)濃度達(dá)到8.0g/L時(shí)，清除率可達(dá)68.3%。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.2 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，黑枸杞酵素面膜對(duì)成纖維細(xì)胞具有很好的增殖作用，與添加防腐劑的進(jìn)行對(duì)比，其效果優(yōu)于添加劑組，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn) ，結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h 的皮膚成纖維細(xì)胞凋亡率明顯降低，已由 49.9%下降到26.3 %（P <0.01） ，結(jié)果見(jiàn)表1.

2.4 安全性試驗(yàn)結(jié)果 家兔眼刺激試驗(yàn)結(jié)果表明，受試家兔眼睛7天內(nèi)指標(biāo)均為正常。根據(jù)“國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局化妝品規(guī)定眼刺激性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)”，評(píng)價(jià)結(jié)果為無(wú)刺激性。

3 討論

酵素含有豐富的酶，人體肌膚中的酵素能促進(jìn)表皮細(xì)胞的新陳代謝，促進(jìn)真皮纖維的再生，起到清潔皮膚，去除油脂消除青春痘，淡化皺紋，改善肌膚狀況，使皮膚緊實(shí)細(xì)致，年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致體內(nèi)酵素的減少，也是皮膚衰老的主要原因之一。因此將現(xiàn)代生物技術(shù)制備的酵素加入到美容產(chǎn)品中，可以起到加強(qiáng)肌膚的健康，延緩皮膚衰老的作用[5]，酵素已然成為一類新興的化妝品功效添加劑。

目前評(píng)價(jià)抗氧化的方法有ABST、DPPH試驗(yàn)、超氧陰離子實(shí)驗(yàn)、羥自由基實(shí)驗(yàn)、脂質(zhì)過(guò)氧化抑制試驗(yàn)、還原能力的測(cè)定[6]，其中DPPH是天然產(chǎn)物抗氧化能力最常使用的一種評(píng)價(jià)方法[7]；羥自由基由于可以使氨基酸、核酸等多種物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)[8]而成為活性很強(qiáng)的自由基，本實(shí)驗(yàn)采用這兩種經(jīng)典方法對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行評(píng)定，試驗(yàn)結(jié)果初步證明了其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，且隨劑量增加而增加；成纖維細(xì)胞是皺紋形成過(guò)程中發(fā)揮主要作用的細(xì)胞，衰老的主要表現(xiàn)為：增殖能力降低和細(xì)胞凋亡率的明顯增加[9]，本試驗(yàn)采用MTT和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)這兩種指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，真實(shí)的反映了供試品對(duì)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特性改變，為本面膜的效果做出了有價(jià)值的評(píng)定，其中MTT法對(duì)無(wú)添加和有添加做了比較，無(wú)添加產(chǎn)品效果明顯好于添加產(chǎn)品，說(shuō)明了化學(xué)類的防腐劑對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用，在有效成分的配合使用下方顯出一定效果，間接證明了它對(duì)皮膚或機(jī)體具有一定的副作用，使用本產(chǎn)品的無(wú)添加形式具有一定的安全性優(yōu)勢(shì)，對(duì)于孕產(chǎn)婦婦女優(yōu)越性更是可觀，安全性評(píng)價(jià)符合嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)定，如前所述，酵素不僅具有很好的抗衰老、改變皮膚狀況作用，而且對(duì)于處方中藥物成分的提取和促進(jìn)皮膚的吸收以至于防腐都有一定的效果，其在國(guó)外已經(jīng)普及使用，但在我國(guó)還處于起步階段，隨著人們對(duì)化妝品綠色、安全、高科技的青睞，本實(shí)驗(yàn)用化妝品具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)

[1] 林麗，張裴斯，晉玲，等.黑果枸杞的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2013，24（17）：4493-4497.

[2] 孫麗萍，王大仟，張智武.11 種天然植物提取物對(duì) DPPH 自由基的清除作用[J].食品科技，2009，30（1）：45 -47.

[3] Zhang Zuofa，Lv Guoying，He Weiqiang，et al.Effects of extractionmethods on the antioxidant activities of polysaccharides obtained from Flammulina velutipes [J].Carbohydrate Polymers，2013，98 （2）：1524-1531.

[4] 王林林，張健等.優(yōu)化貼壁法人皮膚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)[J]南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版，2014，34（1）：124-126.

[5] 董銀卯，何聰芬，王領(lǐng)，等.火龍果酵素生物活性的初步研究[J].食品科技，2009（34）：192-196.

[6] 曾維才，石碧，天然產(chǎn)物抗氧化活性的常見(jiàn)評(píng)價(jià)方法[J]，化工進(jìn)展，2013，32（6）：1205-1211

[7] Sharma O P，BhatPK，DPPH aotinxidant assay revisited[J]，food Chemistry，2009，113（4）：1202-1205.

[8] 郭雪峰，岳永德等.用清除羥自由基法評(píng)價(jià)竹葉提取物抗氧化能力[J].光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（2）：508 -511.

[9] Gentile M，Latonen L，Laiho M，et al.Cell cycle arrest and ap Optosis provoked by UV radiation-induced DNA damage are transcriptionally highly divergent responses. Nucleic Acids Res，2003，31：4779-4790.