楊迪 馮法博 朱丹杰 李曉林 鄒成 沈潔 趙瑜

流行病學(xué)調(diào)查顯示我國成年人2型糖尿病患病率為9.7%～11.6%[1]。研究表明糖尿病患者發(fā)生骨質(zhì)疏松的風(fēng)險明顯高于非糖尿病患者，發(fā)病機制考慮為糖尿病患者破骨細(xì)胞活性增加，成骨細(xì)胞活性下降[2-4]。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平急劇降低，活性氧的增加誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化和增殖，易引發(fā)骨質(zhì)疏松[5]。絕經(jīng)后的2型糖尿病患者存在年齡、絕經(jīng)、糖尿病等骨質(zhì)疏松的多重危險因素，應(yīng)成為防治骨質(zhì)疏松的重點人群。假蒟來源于胡椒科植物假蒟的地上部分，研究發(fā)現(xiàn)假蒟葉水提取物具有較好的抗氧化活性，細(xì)胞及動物實驗證實其對糖尿病、動脈粥樣硬化、高血壓有預(yù)防和治療作用[6-8]。由于氧化應(yīng)激在糖尿病及其并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制中起著重要作用，而假蒟具有降低血糖、抗氧化應(yīng)激功能，因此推測使用假蒟能降低糖尿病患者發(fā)生骨量減少、骨質(zhì)疏松的風(fēng)險。本研究通過對雌性SD大鼠去卵巢手術(shù)后腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（STZ）的方法，復(fù)制伴有2型糖尿病的骨質(zhì)疏松大鼠模型，旨在觀察假蒟對去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠血糖、骨代謝指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、骨小梁的影響，探討其對去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠的治療作用及其機制，為假蒟的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 2月齡清潔級雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200g，購于浙江省實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2014-0001。所有動物于浙江省實驗動物中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，使用許可證號：SYXK（浙）2014-0008。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 3kg烘干假蒟葉購自浙江省中醫(yī)院，切成小片狀，加入蒸餾水（每900ml蒸餾水中加入100g烘干假蒟葉）后煮沸，并以不低于80℃的溫度持續(xù)煎煮3h，假蒟水提取物通過冷凍-干燥后被濃縮和干燥成粉末；密封裝瓶，提取粉末在4℃冰箱保存直至使用。STZ（美國 Sigma公司），戊酸雌二醇（E2）（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司），格列本脲（江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司），TC、TG、鈣（Ca）、磷（P）、骨鈣素（OC）、堿性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司），空腹胰島素（FINS）、糖化血清蛋白（GSP）、E2ELISA 試劑盒（杭州昊天生物科技有限公司），BX60熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），硬組織切片機（德國Leica2500E），DP70彩色數(shù)碼成像系統(tǒng)（北京華躍英泰科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組及去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型建立 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組和假手術(shù)組5組，每組10只。所有大鼠用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，假手術(shù)組找到卵巢后不予結(jié)扎摘除，只切除雙側(cè)卵巢周圍少許脂肪組織；另外4組用線結(jié)扎輸卵管，切除雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型。術(shù)后1周，去卵巢大鼠腹腔注射STZ（35mg/kg），72h后檢測空腹血糖（FBG），以FBG≥11.1mmol/L作為糖尿病模型成功的標(biāo)志。去卵巢糖尿病大鼠飼養(yǎng)10周，形成去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松模型。

1.3.2 各組給藥方法 模型組和假手術(shù)組采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，8ml（/kg·d）。格列本脲組采用格列本脲（配成0.625mg/ml濃度）灌胃，5mg（/kg·d）。E2組采用E2（配成12.5μg/ml濃度）灌胃，100μg（/kg·d）。假蒟組采用假蒟（配成15.625mg/ml濃度）灌胃，125mg（/kg·d）。各組均連續(xù)給藥4周。

1.3.3 實驗指標(biāo)檢測 藥物干預(yù)結(jié)束后，禁食24h，10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血并分離血清，全自動生化檢測儀測量生化指標(biāo)（TC、TG、Ca、P、FBG），采用 ELISA 法檢測 FINS、GSP、E2、晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），試劑盒檢測氧化應(yīng)激指標(biāo)（SOD、MDA）和骨代謝指標(biāo)（OC、AKP）。

1.3.4 組織學(xué)檢測 10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉后急性大失血法（腹主動脈取血）處死各組大鼠。取各組大鼠左側(cè)股骨，4%多聚甲醛固定24h，20%甲酸和15%乙二胺四乙酸脫鈣14d，各級乙醇脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織病理形態(tài)學(xué)改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內(nèi)比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干預(yù)前后血清FBG水平比較 干預(yù)前，假手術(shù)組血清FBG水平均明顯低于其他4組（均P＜0.01）。干預(yù)后，格列本脲組、假蒟組、假手術(shù)組血清FBG水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清FBG水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。干預(yù)后，假蒟組與格列本脲組血清FBG水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)后，模型組、E2組血清FBG水平均較干預(yù)前升高（均P＜0.05），但格列本脲組、假蒟組、假手術(shù)組干預(yù)前后血清FBG水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠干預(yù)后生化指標(biāo)比較 干預(yù)后，格列本脲組、假蒟組、假手術(shù)組血清TC水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組血清TC水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。格列本脲組、E2組、假蒟組、假手術(shù)組血清TG水平均低于模型組（均P＜0.05）。E2組、假手術(shù)組血清E2水平均高于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清E2水平均低于假手術(shù)組（均P＜0.05）。模型組、E2組血清FINS水平均低于假手術(shù)組（均P＜0.05）。模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組血清GSP水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。但各組血Ca及P比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表1 各組大鼠干預(yù)前后血清FBG水平比較（m m ol/L）

表2 各組大鼠干預(yù)后生化指標(biāo)比較

2.3 各組大鼠干預(yù)后骨代謝指標(biāo)比較 格列本脲組、E2組、假蒟組、假手術(shù)組血清AKP水平均低于模型組（均P＜0.05），格列本脲組、E2組、假蒟組血清AKP水平均高于假手術(shù)組（均P＜0.05）。但各組血清OC水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠干預(yù)后骨代謝指標(biāo)比較

2.4 各組大鼠干預(yù)后氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 假蒟組血清SOD活性分別高于假手術(shù)組、模型組（均P＜0.05），格列本脲組血清SOD活性高于假手術(shù)組（P＜0.05）。假蒟組、假手術(shù)組血清MDA水平均低于模型組（均P＜0.05）。格列本脲組、假蒟組、假手術(shù)組血清AGEs水平均低于模型組（均P＜0.05），E2組血清AGEs水平高于假手術(shù)組（P＜0.05），見表 4。

表4 各組大鼠干預(yù)后氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.5 各組大鼠骨組織病理形態(tài)學(xué)改變比較 與假手術(shù)組比較，模型組、格列本脲組、E2組大鼠骨松質(zhì)部位骨小梁明顯減少，排列稀疏、不整齊，部分?jǐn)嗔?，模型組中這種病理變化更加嚴(yán)重；假蒟組骨小梁數(shù)量減少不明顯，排列較規(guī)則，連續(xù)性、完整性較好，見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織病理形態(tài)學(xué)改變（a：假手術(shù)組；b：E2組；c：格列本脲組；d：假蒟組；e：模型組；H E染色，×200倍）

3 討論

高血糖是糖尿病的主要特征，糖尿病慢性并發(fā)癥主要通過長期持續(xù)性高血糖和血糖波動兩種方式產(chǎn)生，而其核心是氧化應(yīng)激[9-10]。在高糖和（或）氧化應(yīng)激條件下，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA和AGEs水平增加，積累的AGEs一方面可通過與其受體結(jié)合促進SOD等抗氧化酶糖基化，削弱機體清除自由基的能力，加重氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，造成多種糖尿病慢性并發(fā)癥；另一方面可通過減少成骨細(xì)胞活性，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和受損的骨基質(zhì)礦化等影響骨重建過程，造成骨質(zhì)損傷，是糖尿病骨質(zhì)疏松的主要成因[11]。因此對血清MDA、AGEs水平和SOD活性持續(xù)監(jiān)測可以明確氧化應(yīng)激狀態(tài)及評估抗氧化療效[12]。

本研究顯示藥物干預(yù)后，與模型組比較，假蒟組SOD活性升高，MDA水平下降，說明假蒟具有抗氧化應(yīng)激作用；格列本脲組、假蒟組血清AGEs水平均低于模型組。綜上，試驗結(jié)果證明假蒟可減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷，推測假蒟可能對去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松存在改善作用。

本研究顯示干預(yù)前模型組、格列本脲組、E2組、假蒟組血清FBG水平均高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明糖尿病模型成功。干預(yù)后，格列本脲組、假蒟組血清FBG水平均低于模型組，說明格列本脲、假蒟有降糖作用。干預(yù)前后格列本脲組與假蒟組血清FBG、FINS水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明假蒟與格列本脲相比，在降糖作用方面具有非劣效性，推測假蒟可能存在促進胰島素分泌作用。本研究中模型組大鼠出現(xiàn)血清TG、TC水平升高，干預(yù)后假蒟組血清TG、TC水平較模型組均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Mohd等[7]研究結(jié)果一致，推測假蒟可能具有降脂作用。

骨形成和骨吸收是骨代謝中兩個緊密相聯(lián)的過程。OC是由成骨細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的一種激素樣多肽，是骨形成的特異而敏感的指標(biāo)，當(dāng)骨更新率加快時，血中OC升高；AKP是反映骨重建指標(biāo)之一；OC和AKP是目前常用的骨形成標(biāo)志物。去卵巢大鼠由于雌激素的缺失會代償性增加OC、AKP分泌，去卵巢骨質(zhì)疏松為高轉(zhuǎn)換型，而糖尿病骨質(zhì)疏松為低轉(zhuǎn)換型，在復(fù)合模型中，可能兩者互相影響，從而導(dǎo)致部分指標(biāo)變化不明顯。本研究中，模型組血清AKP水平高于假手術(shù)組，處于高轉(zhuǎn)換狀態(tài)；干預(yù)后格列本脲組、E2組、假蒟組血清AKP水平均低于模型組。因此，推測假蒟具有降低骨轉(zhuǎn)換，抑制骨吸收的作用。

本研究顯示，與假手術(shù)組比較，模型組、格列本脲組、E2組大鼠骨松質(zhì)部位骨小梁明顯減少，排列稀疏、不整齊，部分?jǐn)嗔?，模型組中這種病理變化更加嚴(yán)重；假蒟組骨小梁數(shù)量減少不明顯，排列較規(guī)則，連續(xù)性、完整性較好。說明假蒟對去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松具有改善作用，下一步需增加樣本量對骨質(zhì)疏松改善程度進行量化。

本研究結(jié)果表明，假蒟降糖效果非劣效于格列本脲，其可能通過改善高血糖狀態(tài)、抗氧化應(yīng)激，從而抑制去卵巢糖尿病骨質(zhì)疏松模型大鼠骨代謝紊亂。