熊汝琴，李才濤

（昭通學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，云南 昭通 657000）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）為蕓香科花椒屬植物的果皮，不僅是常用調(diào)味品之一，而且具有芳香健胃、溫中散寒、除濕止痛、殺蟲(chóng)解毒、止癢解腥等藥效。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)花椒化學(xué)成分及藥理活性研究已十分成熟，研究表明花椒中主要含有揮發(fā)油、酰胺、生物堿、黃酮、多酚、香豆素、木脂素等多種化學(xué)成分[1-2]。其中生物堿是花椒中普遍存在的一類(lèi)活性成分，迄今為止，從花椒中已分離得到二十余種生物堿，如青花椒堿、茵芋堿、白蘚堿、喹諾酮喹啉生物堿、γ-花椒堿、鐵屎米-6-酮、白屈菜紅堿等[3-5]。藥理研究表明，花椒總生物堿具有較寬的抗菌譜，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和釀酒酵母均有抑制作用，還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗瘧疾、抑制血小板凝集等作用[5-7]，是反映花椒內(nèi)在品質(zhì)的主要指標(biāo)。

花椒是經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值較高的農(nóng)產(chǎn)品，在我國(guó)栽培歷史悠久，分布范圍廣泛，昭通地區(qū)的產(chǎn)量約占全省的60～70%。昭通市花椒品種有“大紅袍”和青花椒兩種，其中青花椒人工種植規(guī)模較大，主要分布在永善縣、魯?shù)榭h、彝良縣、巧家縣、鹽津縣、大關(guān)縣等地區(qū)。近年來(lái)隨著國(guó)家提倡振興特色農(nóng)業(yè)發(fā)展，昭通市各級(jí)政府高度重視青花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展，引進(jìn)新技術(shù)發(fā)展地方特色農(nóng)業(yè)，青花椒作為地方經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)支柱，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。目前，昭通市花椒產(chǎn)值達(dá) 10多億元，昭通已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)三大青花椒集散地之一。

目前，對(duì)花椒生物堿的研究報(bào)道主要集中于四川、重慶、陜西等地區(qū)所產(chǎn)花椒[8-9]，但是，由于各地地域不同導(dǎo)致的氣候、雨量、日照和土質(zhì)等很多自然因素存在很大差異，不同產(chǎn)地花椒生物堿含量有很大差異。而昭通青花椒的種植面積雖不斷擴(kuò)大，但對(duì)其生物堿含量的系統(tǒng)研究卻鮮有報(bào)道，缺乏理論數(shù)據(jù)的支撐，加上臨近四川、重慶等花椒種植基地，使得昭通青花椒的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力較弱，品牌效應(yīng)不高。本次研究將對(duì)昭通地區(qū)魯?shù)榭h、彝良縣、永善縣、大關(guān)縣、鹽津縣、巧家縣六個(gè)青花椒主要種植縣所產(chǎn)青花椒生物堿進(jìn)行提取測(cè)定，分析昭通地區(qū)不同海拔高度及地理環(huán)境所產(chǎn)青花椒的生物堿含量，并與其它產(chǎn)地青花椒進(jìn)行對(duì)比，期望為昭通青花椒的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，增加花椒用途，提升價(jià)格，帶動(dòng)花椒產(chǎn)區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。

1 儀器與材料

1.1 儀器

電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；先行者電子分析天平；XFB-200家用粉碎機(jī)（吉首市中湘制藥機(jī)械廠(chǎng)）；PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)（濰坊金水華禹信息科技有限公司）；HH-S型恒溫水浴鍋；UNIC7200可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；移液槍。

1.2 材料與試劑：

青花椒樣品分別采于昭通市魯?shù)榭h梭山鎮(zhèn)，巧家縣大寨鄉(xiāng)，彝良縣角奎鎮(zhèn)，永善縣黃華鎮(zhèn)、鹽津縣廟壩鎮(zhèn)、大關(guān)縣高橋鎮(zhèn)。白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）；碘化鉍鉀；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；無(wú)水乙醇；氯仿（均為分析純）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試液配制

2.1.1 pH值=7.6的溴甲酚綠磷酸緩沖液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取Na2HPO417.90g，溶解定容至250mL容量瓶中，其濃度為0.2mol/L，準(zhǔn)確稱(chēng)取NaH2PO41.56g，溶解定容至50mL容量瓶中，其濃度為0.2mol/L。分別取NaH2PO4溶液87mL，NaH2PO4溶液13mL，稱(chēng)取0.05g溴甲酚綠定容至100mL；即配制成pH值=7.6的溴甲酚綠磷酸緩沖液。

2.1.2 碘化鉍鉀溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取碘化鉍鉀2.00g，加入20mL冰醋酸充分溶解后加入50mL水稀釋即可。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00mg白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品，加無(wú)水乙醇定容至25mL，制得0.2mg/mL白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

準(zhǔn)確吸取取1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)溶液于5支規(guī)格為25mL的試管中，先加入一定量蒸餾水補(bǔ)至5mL，再加入2mL溴甲酚綠磷酸緩沖液，最后加氯仿10mL。振蕩2分鐘后，分別倒入干燥潔凈的分液漏斗中充分搖勻后靜置1小時(shí)。待溶液分層后，取氯仿層(下層)在425nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[10]。

2.3 樣品處理

將昭通六縣區(qū)所產(chǎn)青花椒果皮干至恒重，分別用粉碎機(jī)粉碎后過(guò)60目篩，精確稱(chēng)取5.0g粉末倒入具塞錐形瓶中，平行稱(chēng)三份，加70%乙醇溶液75mL，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=3，室溫浸提5小時(shí)后過(guò)濾。用濃氨水將濾液調(diào)節(jié)至中性，分別取5mL濾液于5支試管中，再分別加入2mL溴甲酚綠磷酸緩沖液和10mL氯仿，振蕩2分鐘后，倒入分液漏斗中充分搖勻靜置1小時(shí)。取分液漏斗上層液1mL，加入1mL碘化鉍鉀溶液，若有橘紅色沉淀生成則繼續(xù)加氯仿至生物堿萃取完全，取氯仿層在425nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度[11-12]。

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

以白屈菜紅堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得線(xiàn)性回歸方程為y= 4.615x + 0.0044，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.9994，說(shuō)明白屈菜紅堿質(zhì)量濃度在0～0.2 mg/mL與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，該方程可用于青花椒總生物堿含量測(cè)定。

圖1 生物堿測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取制備好的供試溶液，按前述2.2測(cè)定方法，在樣品液與顯色劑反應(yīng)完全后，分別在0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h連續(xù)測(cè)定吸光度，所測(cè)吸光度值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.56%，說(shuō)明顯色后的溶液在3.0h內(nèi)穩(wěn)定。

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取制備好的供試溶液，按前述2.2測(cè)定方法，重復(fù)測(cè)定5次，記錄吸光度值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.32%，表明儀器精密度高。

3.4 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

分別稱(chēng)取魯?shù)榭h所產(chǎn)青花椒樣品粉末5份，每份5.0g，按2.3項(xiàng)方法處理后獲得供試溶液，再按2.2項(xiàng)方法測(cè)定吸光度值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.35%，表明重復(fù)性高。

3.5 昭通青花椒總生物堿含量

分別稱(chēng)取昭通六縣區(qū)所產(chǎn)青花椒干燥果皮粉末5.0g，按前述方法提取其中總生物堿制備待測(cè)溶液，采用酸性染料比色法測(cè)定吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總生物堿含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 昭通六縣區(qū)青花椒生物堿含量

從表中可見(jiàn)，昭通地區(qū)六縣所產(chǎn)青花椒中總生物堿含量在0.343%～0.430%之間，沒(méi)有顯著差異。

4 小結(jié)與討論

本文以白屈菜紅堿為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)生物堿可與酸反應(yīng)生成鹽，使其在乙醇中的溶解度增大，用70%乙醇溶液并加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為酸性，充分浸提過(guò)濾后，用濃氨水將濾液調(diào)節(jié)至中性，氯仿萃取生物堿后加溴甲酚綠磷酸緩沖液顯色，于425nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，昭通市六縣區(qū)所產(chǎn)青花椒中總生物堿含量在0.343%～0.430%之間，沒(méi)有顯著差異，本文為昭通青花椒的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。