王偉 裴艷剛 王宇霜 孫霞 戴浩 龔國淑 常小麗

摘要

為探究細(xì)胞微絲骨架在玉米抗紋枯病侵染過程中的作用，采用微絲骨架解聚劑LatB預(yù)處理玉米離體葉片后接種立枯絲核菌Rhizoctonia solani AG1-IA，顯微觀察病原菌的侵染過程，并檢測活性氧（ROS）、細(xì)胞壞死及抗病基因（PR1、ZmDREB2A）表達(dá)等抗病反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，與未經(jīng)LatB預(yù)處理相比，LatB預(yù)處理加快了R.solani侵染后玉米病斑的形成，并影響了侵染結(jié)構(gòu)的發(fā)育;在侵染后期，LatB促進(jìn)了R.solani誘導(dǎo)的玉米葉片中ROS積累、細(xì)胞壞死反應(yīng)和PR1基因表達(dá);溶劑DMSO預(yù)處理與未經(jīng)LatB預(yù)處理的結(jié)果類似，表明DMSO對本試驗的影響較小。研究表明，細(xì)胞微絲骨架不僅參與玉米抗R.solani的侵入，而且通過調(diào)控ROS、PR1基因表達(dá)，細(xì)胞死亡等抗病信號提高玉米抗病防御能力。本研究為進(jìn)一步研究細(xì)胞微絲骨架在玉米對紋枯病的抗病機(jī)理中的作用提供了重要參考。

關(guān)鍵詞

玉米; 立枯絲核菌; 細(xì)胞微絲骨架; 活性氧; 抗病基因

中圖分類號：

S 435.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2016252

Roles of actin filaments in defense against Rhizoctonia solani

causing banded leaf and sheath blight of maize

WANG Wei， PEI Yangang， WANG Yushuang， SUN Xia， DAI Hao， GONG Guoshu， CHANG Xiaoli

（College of Agriculture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract

In order to find out the role of cellular actin filaments in maize resistance to Rhizoctonia solani causing banded leaf and sheath blight， detached maize leaves were pretreated with the actin filament depolarization， latrunculin B （LatB）， before inoculation with R.solani AG1-IA， and then collected at different time points in this study. Disease development and pathogen infectious structures were observed through the microscope， and meanwhile， defense responses including ROS accumulation， cell death and defense gene expression （PR1 and ZmDREB2A） were also examined. The results showed that， compared to inoculation with R.solani alone， pretreatment with LatB led to an earlier disease lesions and development of infectious structures. Additionally， ROS accumulation， cell death and defense gene expression were much higher than that without LatB pretreatment. In addition， pretreatment with the solvent DMSO showed similar results to the control without LatB treatment， indicating that DMSO had little effect on the LatB treatment. These data demonstrated that cellular cytoskeletal actin filaments not only functioned on pathogen invasion， but also regulated ROS accumulation， PR1 expression and cell death， all of which worked together to suppress pathogen spread on maize leaves and enhance maize resistance. This study provides important information for further studies on the role of actin filaments in maize resistance.

Key words

maize; Rhizoctonia solani; cellular actin filaments; ROS; defense-related gene

玉米Zea mays L.是世界三大谷類作物之一，既作為主要的食、飼兼用作物，也是重要的工業(yè)及能源原料，對國家的糧食安全起著舉足輕重的作用[1]。玉米紋枯?。╞anded leaf and sheath blight，BLSB）是國內(nèi)外玉米產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生、且危害嚴(yán)重的土傳病害之一[2]。在我國，玉米紋枯病菌以立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn融合菌群AG1-IA為優(yōu)勢病原菌，其具有土傳性、寄主范圍廣、適應(yīng)性強(qiáng)和高致病性等特點(diǎn)[3-4]。近年來，由于我國高投入、單一化大面積的玉米種植模式，導(dǎo)致玉米紋枯病發(fā)生日趨嚴(yán)重，成為我國各玉米產(chǎn)區(qū)的主要病害之一[1]，嚴(yán)重影響玉米產(chǎn)量。選育和利用抗病玉米品種是防治玉米紋枯病最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑[2]，然而，國內(nèi)外關(guān)于玉米抗紋枯病機(jī)制有待深入研究。細(xì)胞微絲骨架（actin filaments）是植物細(xì)胞骨架的重要組成結(jié)構(gòu)，其在生物體內(nèi)行使多種生理功能，同時也參與植物抗病防御過程[5-6]。研究表明，細(xì)胞微絲骨架的動態(tài)變化參與了病原菌侵染點(diǎn)細(xì)胞壁乳突形成相關(guān)物質(zhì)的運(yùn)輸[6]、保衛(wèi)細(xì)胞中K+離子通道的開閉[7]、NO誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[8]、活性氧積累（ROS）、細(xì)胞壞死反應(yīng)及抗病相關(guān)基因的表達(dá)等抗病防御相關(guān)反應(yīng)[6]。目前，關(guān)于細(xì)胞微絲骨架在玉米抗紋枯病侵染過程中的作用機(jī)制研究較少。

本研究通過細(xì)胞微絲骨架解聚劑LatB預(yù)處理后接種玉米紋枯病致病菌立枯絲核菌R.solani AG1-IA，觀察玉米葉片病斑擴(kuò)展及R.solani侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育情況，檢測葉片中活性氧（ROS）積累、細(xì)胞壞死及抗病基因（PR1、ZmDREB2A）表達(dá)等抗病防御反應(yīng)情況，旨在初步探明細(xì)胞微絲骨架在玉米對紋枯病抗病過程中的作用，為玉米抗病育種及紋枯病防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種及菌株

供試玉米品種為‘登海605，購自山東登海種業(yè)股份有限公司，為常規(guī)品種，經(jīng)抗性鑒定對紋枯病表現(xiàn)為中抗;立枯絲核菌Rhizoctonia solani Kühn融合群菌株AG1-IA由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系實驗室提供。

1.2 試劑及儀器

主要試劑：微絲骨架解聚劑latrunculin B （LatB），購自Sigma-Aldrich公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser購自寶生物工程（大連）有限公司;TRIzol總RNA提取試劑盒、Taq PCR Master Mix、DNA Marker、核酸染料等均購自天根生化科技有限公司;二氨基聯(lián)苯胺DAB（3，3-diaminobenzidine）、臺盼藍(lán)（Trypan Blue）、DMSO（二甲基亞砜）、瓊脂糖、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、三氯乙醇、甘油及其余常規(guī)試劑購自成都博大泰克生物公司。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

主要儀器：5424R型臺式高速冷凍離心機(jī)、Universal Hood II凝膠成像儀、C1000 PCR擴(kuò)增儀，購自美國Bio-Rad公司;Nanodrop 2 000超微量分光光度計，購自美國Thermo Scientific公司;DYY-6C型凝膠電泳儀，購自北京六一儀器廠;Nikon Eclipse 80i顯微鏡購自日本Nikon公司;GXM型智能光照培養(yǎng)箱，購自寧波江南儀器廠，以上儀器均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米盆栽苗培育

將玉米種子用75%乙醇處理1 min，然后用0.1%的次氯酸鈉處理20 s，蒸餾水沖洗3～5 次，將消毒好的玉米種子置于培養(yǎng)皿中經(jīng)無菌水浸潤滅菌濾紙上，于生長溫度22～28℃、相對濕度75%的恒溫箱中培養(yǎng)催芽，1 d后取出移栽于裝有滅菌基質(zhì)土的直徑10 cm的花盆中，當(dāng)玉米長至5～6片葉時進(jìn)行接種處理。

1.3.2 病原菌活化及接種

將AG1-IA菌株接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基（PDA，馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂10 g，水1 000 mL），置于25～28℃恒溫下擴(kuò)大培養(yǎng)3 d，至長滿整個培養(yǎng)皿待用。

將玉米葉片剪成長4 cm、寬2 cm的葉段，置于墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中保濕。參照Henty-Ridilla等[9]的使用濃度，將微絲骨架解聚劑latrunculin B（LatB）先用DMSO（二甲基亞砜）配制成2 mol/L的母液，再用蒸餾水稀釋至2 mmol/L作為工作濃度，以確保DMSO濃度小于0.1%，不影響LatB的作用效果。采用無針頭注射器將20 μL LatB （2 mmol/L）注入玉米葉肉細(xì)胞中，30 min后接種AG1-IA菌餅于注射部位作為處理樣品，以注射等體積DMSO和滅菌蒸餾水后接種AG1-IA的葉片為對照，每個處理重復(fù)3次，試驗進(jìn)行3次。接種后置于25℃保濕培養(yǎng)過夜，并于接種后不同時間點(diǎn)（0、6、12、24、48 h和72 h）收集材料，用于病原菌侵染結(jié)構(gòu)觀察及抗病相關(guān)反應(yīng)檢測。

1.3.3 玉米紋枯病菌侵染結(jié)構(gòu)的觀察

于接種后不同時間點(diǎn)（0、6、12、24、48 h和72 h）取接種葉段材料，用脫色液（無水乙醇∶甘油∶無菌水，體積比為15∶1∶4）沸水浴脫色1 h至透明，然后用考馬斯亮藍(lán)染色液（0.15%三氯乙酸水溶液∶0.6%考馬斯亮藍(lán)R-250甲醇溶液，體積比1∶1）染色10 min，最后用自來水漂洗3～5次至染液洗凈。制片，并在顯微鏡（Nikon Eclipse 80i）下觀察病原菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育。

1.3.4 活性氧測定

活性氧（ROS）的檢測采用二氨基聯(lián)苯胺DAB（3，3-diaminobenzidine）染色法 [10]。取接種后不同時間段的玉米葉片，蒸餾水洗凈后置于15 mL離心管中，加入適量DAB染液（1 mg/mL，pH 5.8）至完全浸沒葉片，用真空抽濾泵抽濾5 min 后置于28℃避光保存8 h，隨后取出離心管光照1 h至紅棕色斑點(diǎn)顯現(xiàn)。棄掉各管染液，用無菌水漂洗3次洗去浮色，加入脫色液（無水乙醇∶甘油∶水，體積比15∶1∶4），沸水浴直至葉片綠色完全褪去，重復(fù)1次，重新加入脫色液，置于4℃冰箱內(nèi)保存。拍照后，采用Image J軟件統(tǒng)計染色面積占總?cè)~片面積的百分比，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞ROS產(chǎn)生情況。

1.3.5 細(xì)胞壞死觀察

葉片細(xì)胞壞死采用臺盼藍(lán)染色法[10]進(jìn)行檢測。取接種后不同時間段的玉米葉片，蒸餾水洗凈后置于培養(yǎng)皿中，加入適量臺盼藍(lán)染液（乳酸∶水飽和酚∶甘油∶1 mg/mL臺盼藍(lán)，體積比1∶1∶1∶1）至完全浸沒葉片，28℃下放置4 h。隨后取出葉片， 用無菌水漂洗3次，洗去浮色后放入15 mL離心管中，加入脫色液（無水乙醇∶甘油∶水，體積比15∶1∶4），并沸水浴直至葉片綠色完全褪去，棄掉各管液體重新加入脫色液，置于4℃冰箱內(nèi)保存并拍照記錄，計算染色面積占葉片總面積的百分比，用以評價細(xì)胞壞死情況。

1.3.6 抗病相關(guān)基因表達(dá)檢測

在接種后0、6、12、24、48和72 h后分別取處理葉片200 mg，無菌水洗凈，滅菌紙擦干后加入液氮進(jìn)行研磨，參照TRIzol試劑盒操作手冊提取總RNA。用NanoDrop 2 000超微量分光光度計檢測RNA的質(zhì)量。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，反應(yīng)體系包括：1 μL Oligo dT18 Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL Fracs Script RT/RI Enzyme Mix、gRNA Remover，用RNase-free Water補(bǔ)足至20 μL，反應(yīng)條件為：42℃，30 min;85℃，5 min;4℃，保存。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用ddH2O按1∶20（V/V）稀釋后待用。PCR擴(kuò)增體系為：12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix、9.5 μL 滅菌ddH2O、1 μL Primer F、1 μL Primer R、1 μL cDNA。引物序列分別為：18S rRNA （F： 5′-TCCTGAGTAACGAACGAGACC-3′和R：5′-CACGATGAAATTTCCCAAGAT-3′）[8]，PR1 （F：5′-AGGCTCGCGTGCCTCCTAGCTCTGG-3′和R： 5′-GGAGTCGCGCCACACACCTGCGTG-3′）[8]，ZmDREB2A （F： 5′-GTATCTTGATGAGCTGGGATTCGAG-3′和R：5′-GTGAAGCAAACCCAGTTCCC-3′）[11]。擴(kuò)增條件為：94℃ 變性5 min;94℃變性30 s，58℃ 退火20 s，72℃延伸20 s，循環(huán)40次，72℃延伸5 min，4℃保持。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并采用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。

1.3.7 統(tǒng)計分析

用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t測驗對經(jīng)兩種不同接種處理的玉米葉片中ROS、細(xì)胞壞死反應(yīng)、菌絲體量進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平為5%，并使用Excel 2010軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LatB預(yù)處理對玉米葉片發(fā)病情況的影響

采用R.solani AG1-IA接種玉米離體葉片后觀察病斑擴(kuò)展情況。結(jié)果如圖1所示，在接種后0～6 h，LatB預(yù)處理、DMSO溶劑處理以及未經(jīng)預(yù)處理的玉米葉片均未出現(xiàn)病斑。LatB預(yù)處理30 min后接種的玉米葉片在接種菌后12 h開始出現(xiàn)水漬狀小病斑，且病斑處褪綠變黃;24～48 h時，病斑擴(kuò)大且出現(xiàn)明顯壞死;72 h時，葉片上出現(xiàn)典型的紋枯病危害后的云紋狀壞死病斑。未預(yù)處理的玉米葉片在接種后24 h開始出現(xiàn)水漬狀小病斑;接菌后48 h時，出現(xiàn)不同程度的、較多的病斑;隨著病斑的擴(kuò)展，72 h時玉米葉片均出現(xiàn)較為明顯的紋枯病水漬狀云紋病斑。與未預(yù)處理葉片相似，DMSO預(yù)處理后接種的玉米葉片在24 h開始出現(xiàn)零星水漬狀褪綠變黃斑，到48 h后病斑面積開始快速擴(kuò)散，到72 h時葉片表面均勻出現(xiàn)云紋狀紋枯病典型癥狀。結(jié)果表明LatB預(yù)處理加快了玉米離體葉片上病斑的出現(xiàn)，加速了玉米對R.solani的抗性反應(yīng)。

2.2 LatB預(yù)處理對紋枯病菌侵染結(jié)構(gòu)的影響

采用考馬斯亮藍(lán)對接種后不同時間點(diǎn)病原菌侵染結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，結(jié)果如圖2所示。未經(jīng)LatB預(yù)處理的葉片（圖2，1a～1f），在接種后6 h時，菌絲伸長，并出現(xiàn)初級分枝（圖2，1a）;接種12 h時，在初級分枝上出現(xiàn)許多短粗狀的側(cè)枝（圖2，1b）;隨后的24～48 h，側(cè)枝頂端膨大形成裂瓣狀的附著胞（圖2，1c），且附著胞下形成侵染釘可直接侵入寄主表皮細(xì)胞（圖2，1d），也可通過氣孔侵入（圖2，1e）;接種72 h時，大量側(cè)枝及附著胞相互聚集在一起（圖2，1f）。溶劑DMSO預(yù)處理后接種病菌結(jié)果顯示，菌絲在接種后6 h不斷伸長（圖2，2a）;12 h時菌絲產(chǎn)生初級分枝，并且從氣孔侵入玉米葉片（圖2，2b）;接種24 h時，菌絲側(cè)枝頂端開始形成瓣狀附著胞（圖2，2c）;接種48 h時，附著胞下產(chǎn)生侵入釘（圖2，2e），菌絲變粗變短，分枝間距縮短（圖2，2d）;接種72 h時，大量附著胞開始串生或簇生在一起，形成巨大的瓣狀復(fù)合體（圖2，2f）。經(jīng)LatB預(yù)處理30 min后接種病原菌6 h時，菌絲頂端開始膨大（圖2，3a）;12 h時，出現(xiàn)初級分枝，且初級分枝頂端膨大呈球形（圖2，3b）;接種24 h時，初級分枝上出現(xiàn)馬蹄型侵染墊，且能觀察到侵入釘侵染玉米表皮細(xì)胞（圖2，3c）;接種48 h，菌絲體繼續(xù)分枝，大量馬蹄形侵染墊形成（圖2，3d），且在氣孔處聚集大量菌絲體（圖2，3e）;72 h時，墊狀侵染結(jié)構(gòu)及病原菌菌絲體均大量增加且聚集在一起（圖2，3f）。結(jié)果表明LatB預(yù)處理對R.solani AG1-IA侵染結(jié)構(gòu)在玉米葉片上的發(fā)育有影響，有利于病原菌的迅速入侵。

圖1 不同接種處理后玉米葉片病斑擴(kuò)展情況

Fig.1 Disease lesion development after inoculated by Rhizoctonia solani AG1-IA with or

without LatB pre-treatment on maize leaves

2.3 LatB預(yù)處理對接種后玉米葉片細(xì)胞內(nèi)活性氧積累的影響

經(jīng)LatB預(yù)處理，接種R.solani后不同時間點(diǎn)取玉米葉片用DAB染色，以DMSO預(yù)處理及未預(yù)處理作為對照，對ROS積累面積百分比進(jìn)行統(tǒng)計，如圖3所示，接種后6 ～12 h ROS開始積累，LatB預(yù)處理與未處理的葉片ROS積累量相當(dāng);接種后24 h，ROS積累量開始逐漸增加，經(jīng)LatB預(yù)處理的葉片中ROS積累量顯著高于未處理的葉片;接種后48 h，ROS積累量達(dá)到峰值，且經(jīng)LatB預(yù)處理的葉片中的ROS積累量是未經(jīng)LatB處理的2倍，隨后接種72 h后ROS積累量有所降低。隨著病原菌侵入，在24～72 h，在相同時間點(diǎn)經(jīng)LatB預(yù)處理的葉片中ROS積累量始終顯著高于未經(jīng)LatB處理的葉片;其中，在使用溶劑DMSO處理后，在0～24 h時，活性氧的積累量都很低，當(dāng)處理48 h后，活性氧的積累量顯著快速增加，基本與未用LatB預(yù)處理的活性氧的積累量相同，但遠(yuǎn)低于經(jīng)過LatB預(yù)處理組（圖3）。結(jié)果表明細(xì)胞微絲骨架解聚劑LatB預(yù)處理可提高R.solani AG1-IA誘導(dǎo)的玉米葉片中ROS的積累量。

圖2 不同預(yù)處理后Rhizoctonia solani AG1-IA侵染結(jié)構(gòu)顯微觀察

Fig.2 Microscopy observation of Rhizoctonia solani AG1-IA infectious structure after different pretreatments on maize leaves

圖3 不同接種處理后玉米葉片活性氧產(chǎn)生面積百分比

Fig.3 ROS production in maize leaves after different

inoculation with Rhizoctonia solani AG1-IA

2.4 LatB預(yù)處理對接種后玉米葉片細(xì)胞壞死情況的影響

經(jīng)LatB預(yù)處理，接種R.solani后不同時間點(diǎn)玉米葉片的細(xì)胞死亡情況采用臺盼藍(lán)染色法進(jìn)行檢測，以DMSO預(yù)處理及未預(yù)處理作為對照，統(tǒng)計葉片壞死斑面積百分比，結(jié)果如圖4所示。在接種0 h時，各處理均無明顯細(xì)胞死亡出現(xiàn);接種后6～12 h，三種處理均有細(xì)胞死亡產(chǎn)生，未處理與DMSO預(yù)處理細(xì)胞死亡差異不顯著，但LatB預(yù)處理的葉片細(xì)胞死亡面積顯著增加;接種后24～48 h，未處理和DMSO預(yù)處理玉米葉片藍(lán)色壞死斑開始大量出現(xiàn)，但在相同時間內(nèi)其壞死斑面積較經(jīng)LatB預(yù)處理略高;接種后72 h，各處理葉片經(jīng)LatB預(yù)處理的葉片和未處理的葉片中細(xì)胞壞死面積相當(dāng)。結(jié)果表明細(xì)胞微絲骨架解聚劑LatB處理后導(dǎo)致玉米葉片細(xì)胞微絲骨架解聚，在R.solani AG1-IA侵染前期，玉米葉片細(xì)胞大量死亡，以提高寄主的防御功能，減少自身受到損害。

2.5 LatB預(yù)處理對接種后玉米葉片抗病相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了檢測LatB預(yù)處理對病原菌R.solani AG1-IA接種后玉米葉片抗病相關(guān)基因的表達(dá)情況，本試驗選擇了病程相關(guān)蛋白PR1和玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmDREB2A兩個基因，以18S rRNA作為內(nèi)參持家基因，采用半定量RT-PCR，在接種后不同時間點(diǎn)檢測其表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示：DMSO預(yù)處理、LatB預(yù)處理以及未經(jīng)LatB預(yù)處理的玉米葉片中持家基因18S rRNA在接種后不同時間點(diǎn)的表達(dá)量基本相同，說明提取獲得的玉米葉片總RNA穩(wěn)定。在LatB預(yù)處理30 min后接種R.solani的玉米葉片中，PR1在接種12 h被誘導(dǎo)表達(dá)，24 h被抑制，隨后48 h表達(dá)量最大，72 h表達(dá)量明顯降低;而在未經(jīng)LatB預(yù)處理的玉米葉片中，PR1在接種后48 h表達(dá)量顯著增加，其他時間與0 h相比，變化不明顯。ZmDREB2A基因在兩種處理中的表達(dá)量在LatB預(yù)處理的玉米葉片中于接種后12 h有所升高，其他時間點(diǎn)變化不明顯，而在未經(jīng)LatB預(yù)處理的玉米葉片以及使用溶劑DMSO預(yù)處理的玉米葉片中各時間點(diǎn)均無特別顯著變化。結(jié)果表明，細(xì)胞骨架解聚劑LatB預(yù)處理對轉(zhuǎn)錄因子ZmDREB2A的影響較小，但可強(qiáng)烈誘導(dǎo)水楊酸（SA）途徑相關(guān)的PR1基因表達(dá)，可能與SA參與到玉米抗紋枯病防御機(jī)制有關(guān)。

圖4 不同接種處理后玉米葉片細(xì)胞壞死情況

Fig.4 Necrotic cell areas of maize leaves after different

inoculation with Rhizoctonia solani AG1-IA

3 討論

植物在與病原菌長期共進(jìn)化互作過程中形成了一套十分復(fù)雜、精密的防御機(jī)制，細(xì)胞微絲骨架作為細(xì)胞骨架的重要組成結(jié)構(gòu)，在植物抵御病原菌侵染過程時常發(fā)生解聚與聚合，在病原菌侵入及擴(kuò)展過程中均發(fā)揮了重要作用[6，12]。本試驗通過微絲骨架解聚劑預(yù)處理玉米葉片后接種紋枯病菌R.solani AG1-IA，對病原菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育情況及玉米抗病相關(guān)反應(yīng)檢測，初步明確了細(xì)胞微絲骨架在玉米抗紋枯病菌侵染中的作用。

圖5 抗病基因的半定量RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測

Fig.5 Representative agarose gels for semi-quantitative RT-PCR of defense gene expression

大量研究表明，細(xì)胞微絲骨架是植物抵御病原菌侵入的重要方式[12]。病原菌侵染后微絲骨架可在侵染點(diǎn)附近聚集，呈放射狀排列，參與寄主細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗病相關(guān)物質(zhì)及蛋白運(yùn)輸?shù)讲≡秩疚稽c(diǎn)的過程[6]。Henty-Ridilla及其團(tuán)隊研究表明，受丁香假單胞桿菌Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000、農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens和稻瘟病菌Magnaporthe grisea侵染1 h后均能觀察到細(xì)胞微絲骨架聚集。采用細(xì)胞松弛素或者微絲骨架解聚劑LatB處理則病原菌成功侵染[9，14-15]。最近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞微絲骨架參與了大豆對病毒病的抗性，微絲骨架解聚有利于大豆花葉病毒病的發(fā)生[16]。本試驗中，立枯絲核菌R.solani為兼性寄生菌，該菌常以侵染墊或裂片狀附著胞侵染寄主，或者不產(chǎn)生專門的侵染結(jié)構(gòu)，而由菌絲頂端直接穿透植物表面或從自然孔口（主要是氣孔）及傷口侵入。本試驗采用細(xì)胞微絲骨架解聚劑LatB處理離體玉米葉片30 min后接種R.solani，觀察到病原菌菌絲分枝后迅速形成馬蹄狀侵染墊，并發(fā)育成侵入釘直接穿透表皮細(xì)胞完成侵入（圖2，3c），在接種后6～12 h迅速出現(xiàn)病斑;而在未經(jīng)LatB預(yù)處理的玉米葉片上，R.solani菌絲則出現(xiàn)較多側(cè)枝后才形成短粗分瓣狀的附著胞及侵入釘，或者延伸至氣孔處進(jìn)行侵入（圖2，1c），在接種后24 h出現(xiàn)病斑（圖4），表明細(xì)胞微絲骨架參與了寄主抵抗病原菌侵入的過程，LatB預(yù)處理導(dǎo)致微絲骨架解聚，破壞了依賴于微絲骨架的玉米葉片抗侵入結(jié)構(gòu)，而有利于病原菌的菌絲快速發(fā)育成馬蹄狀侵染墊，其與多分支的裂瓣狀附著胞相比能更迅速侵入寄主，并建立寄生關(guān)系。這一結(jié)果從Marshall等[17]的試驗也得到證實，即紋枯病菌在水稻感病品種葉鞘表面形成大量的侵染墊，而抗病品種上則不形成侵染墊，只形成裂瓣狀的附著胞。

已有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞微絲骨架不僅對侵染點(diǎn)附近原生質(zhì)凝集和乳突積累有影響，還參與調(diào)控植物的抗病防御反應(yīng)，如活性氧（ROS）積累、細(xì)胞死亡及抗病基因的表達(dá)[18-20]。采用微絲骨架解聚劑cytochalasin A處理后發(fā)現(xiàn)，白粉菌誘導(dǎo)的黃瓜葉片中過敏性細(xì)胞壞死、H2O2的產(chǎn)生及乳突的形成均明顯受抑，表明微絲骨架解聚可促進(jìn)小麥白粉菌的侵染[14，21]。采用細(xì)胞松弛素D處理，能夠顯著降低小麥-白粉菌互作[22]、小麥-葉銹病菌互作[23]、馬鈴薯-晚疫病菌互作[24]中寄主葉片細(xì)胞壞死的產(chǎn)生。與前人研究結(jié)果不同，本試驗中，LatB預(yù)處理后接種病原菌，ROS在接種后24 h大量積累，推測可能與微絲骨架解聚能夠誘導(dǎo)寄主抗病信號有關(guān)，從而抑制病原菌的擴(kuò)展。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)，LatB預(yù)處理提高R.solani 誘導(dǎo)的水楊酸抗病信號相關(guān)的PR1基因大量表達(dá)，表明在玉米紋枯病抗病反應(yīng)中，細(xì)胞微絲骨架的作用與水楊酸途徑有關(guān)，這一結(jié)果與Matouková等[25]的研究結(jié)果相似。

此外，本試驗為排除溶劑DMSO對細(xì)胞微絲骨架解聚劑LatB效果的影響，補(bǔ)充設(shè)置了溶劑DMSO預(yù)處理對照，結(jié)果表明，DMSO預(yù)處理后接種R.solani 的玉米葉片上菌絲及其他侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育、葉片活性氧的積累量、細(xì)胞壞死以及抗病相關(guān)基因與未經(jīng)LatB預(yù)處理組結(jié)果相似，表明溶劑DMSO在本次試驗中對試驗結(jié)果的影響可以忽略。

綜上，本試驗通過組織細(xì)胞染色法及抗病基因表達(dá)檢測，初步明確了細(xì)胞微絲骨架可影響病原菌在玉米葉片上的發(fā)育及侵入過程，也參與了玉米抗病防御相關(guān)的ROS、細(xì)胞死亡及抗病基因表達(dá)水平，這為深入研究玉米對紋枯病抗病機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。然而，玉米紋枯病作為一種世界性的玉米病害難題，由于R.solani在室內(nèi)人工培養(yǎng)條件下很難產(chǎn)孢，因此試驗采用菌餅接種法，可能導(dǎo)致對病原菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育的觀察較實際情況晚。此外，本研究采用細(xì)胞微絲骨架解聚劑間接研究了其在玉米紋枯病抗病機(jī)制中的作用。為了更清楚直觀地觀察R.solani接種后玉米葉片微絲骨架結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，目前本課題組正嘗試通過免疫熒光蛋白標(biāo)記紋枯病菌和細(xì)胞微絲骨架，從而實現(xiàn)激光共聚焦顯微鏡實時觀察紋枯病菌與玉米互作過程中微絲骨架的動態(tài)變化。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）