喻大昭 曾凡松

摘要

基因?qū)蚣僬f(shuō)闡明了病原菌無(wú)毒基因（avirulence gene， Avr gene）與寄主植物抗性基因（resistance gene， R gene）相互識(shí)別和互作的關(guān)系。禾谷類白粉菌無(wú)毒基因產(chǎn)物作為重要的激發(fā)子，能夠與其寄主R基因產(chǎn)物發(fā)生特異性互作，誘導(dǎo)植物細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)。為了更加深入地了解這些無(wú)毒基因的作用，作者總結(jié)了最近關(guān)于AVRa1、AVRa10、AVRa13、AVRk1、AvrPm2和AvrPm3a2/f2等已克隆無(wú)毒基因的研究進(jìn)展，討論了它們作為效應(yīng)蛋白（effector）或激發(fā)子的雙重功能，在毒性菌株中的變異規(guī)律，與其對(duì)應(yīng)R基因之間的互作模型，以及與轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列之間的關(guān)聯(lián)等。本文還對(duì)無(wú)毒基因研究方法的改進(jìn)和未來(lái)的研究方向提出了建議。

關(guān)鍵詞

無(wú)毒基因; 禾谷類白粉菌

中圖分類號(hào)：

S 435.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018290

Avirulence genes in cereal powdery mildews

YU Dazhao， ZENG Fansong

（Key Laboratory for Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture of

China， Hubei Key Laboratory for Control of Crop Diseases， Insect Pests and Weeds， Institute of

Plant Protection and Soil Science， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract

The gene-for-gene hypothesis elucidates the recognition and interaction between avirulence gene （Avr gene） of pathogens and resistance gene （R gene） of hosts. Avr protein of the cereal powdery mildew pathogens， as important elicitors inducing defense reaction in plant cells， can interact specifically with the cognate R proteins of their hosts. To further understand the roles played by these Avr genes， we summarized the recent progress in Avr genes like AVRa1， AVRa10， AVRa13， AVRk1， AvrPm2 and AvrPm3a2/f2. The dual function of these avirulence genes acting as effectors or elicitors， their variation in virulent isolates， the interaction models between them and their cognate R genes， as well as their association with repetitive sequences such as transposons were discussed. Better methodologies used for Avr gene studies and future research focus were also suggested.

Key words

avirulence gene; cereal powdery mildews

在符合基因?qū)驅(qū)W說(shuō)的植物病害中，植物的抗性基因（resistance gene， R gene）與病原菌的無(wú)毒基因（avirulence gene， Avr gene）相互識(shí)別，激發(fā)植物抗病性[1-2]。大多數(shù)R基因編碼保守的NLR（nucleotide-binding， leucine-rich repeat receptor， NLR）受體類蛋白[3]。R蛋白直接或間接地與其對(duì)應(yīng)的無(wú)毒基因產(chǎn)物識(shí)別，激發(fā)植物細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive reaction， HR）[4]。一方面，在R蛋白施加的選擇壓力作用下，病原菌通過(guò)效應(yīng)子（effector）的進(jìn)化來(lái)逃避R蛋白的識(shí)別，從而阻止寄主產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)[5]。另一方面，由于R蛋白識(shí)別的特異性主要是受其富含亮氨酸重復(fù)（leucine-rich repeat，LRR）結(jié)構(gòu)域控制的，植物可以通過(guò)LRR結(jié)構(gòu)域中少數(shù)幾個(gè)氨基酸的突變對(duì)抗性進(jìn)行修飾[6]。因此，植物R蛋白與病原菌Avr蛋白之間存在著協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。由禾布氏白粉菌Blumeria graminis引起的禾谷類白粉病是大麥和小麥等作物上的重要病害，且白粉菌與其寄主之間存在基因?qū)蜿P(guān)系[7-8]。白粉菌無(wú)毒基因的克隆和功能分析不僅有助于從分子層面上理解病原菌毒性變異和與寄主協(xié)同進(jìn)化的機(jī)制，而且有助于建立病原菌致病型快速檢測(cè)技術(shù)，監(jiān)測(cè)病原菌的毒性變異，以便合理有效地利用抗性資源。因此，作者對(duì)禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的來(lái)源、克隆、特征、功能、變異及其研究方法等方面進(jìn)行了歸納和總結(jié)。

1 禾谷類白粉菌效應(yīng)子基因

病原菌通過(guò)向植物細(xì)胞中注入一類被稱為效應(yīng)子的分泌性毒性因子來(lái)抑制植物先天免疫反應(yīng)[9]。在這些效應(yīng)子基因中，一些能夠被植物特定的R蛋白識(shí)別的基因被稱為無(wú)毒基因[10]。因此，效應(yīng)子基因的鑒定可以為無(wú)毒基因的克隆提供候選基因。大麥白粉菌B.graminis f.sp. hordei（Bgh）基因組分析結(jié)果表明，Bgh含有491個(gè)N端帶有信號(hào)肽的候選分泌性效應(yīng)子蛋白（candidate secreted effector protein， CSEP）[11-12]。在小麥白粉菌B.graminis f.sp.tritici（Bgt）的基因組中鑒定出了437個(gè)CSEP編碼基因和165個(gè)不含有信號(hào)肽的效應(yīng)子基因。

而且，大部分Bgh效應(yīng)子基因（79%）和Bgt效應(yīng)子基因（99%）在吸器中表達(dá)，暗示它們可能在禾谷類白粉菌與寄主互作和致病過(guò)程中發(fā)揮作用[11， 13]。序列特征分析表明，白粉菌的這些效應(yīng)子基因通常編碼比較小的蛋白，在序列上與其他真菌的基因沒(méi)有同源性，它們彼此具有明顯的序列分化[12]，說(shuō)明它們可能靶向寄主細(xì)胞中不同的蛋白，執(zhí)行不同的功能。但是，大多數(shù)CSEP的N端信號(hào)肽下游含有一個(gè)保守的YFWxC基序[14]。該基序的保守性提示它們可能與卵菌效應(yīng)子保守RxLR基序類似，在效應(yīng)子蛋白分泌進(jìn)入植物細(xì)胞過(guò)程中起作用[15]。另外，與其他非CSEP基因相比，CSEP基因具有更高的氨基酸替換dN/dS比值，這說(shuō)明效應(yīng)子基因存在明顯的多樣化選擇趨勢(shì)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中具有更快的進(jìn)化速率[13， 16-17]。

2 禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的特征和功能

到目前為止，在禾谷類白粉菌無(wú)毒基因中，只有少數(shù)幾個(gè)被克隆。從20世紀(jì)90年代開(kāi)始，一些植病工作者對(duì)Bgh的無(wú)毒基因進(jìn)行了遺傳分析。對(duì)菌株雜交后代的分析結(jié)果表明，AVRa6和AVRa7的無(wú)毒性均由兩個(gè)位點(diǎn)控制[18-20]。最近的研究表明，小麥白粉菌無(wú)毒基因AvrPm3位點(diǎn)的情況更加復(fù)雜。對(duì)菌株96224與菌株94202的雜交后代表型分析發(fā)現(xiàn)，AvrPm3b和AvrPm3d的無(wú)毒位點(diǎn)由3個(gè)無(wú)毒位點(diǎn)控制[21-22]。這些結(jié)果說(shuō)明多個(gè)基因參與了白粉菌與寄主之間的識(shí)別和互作。

AVRk1和AVRa10是最早從禾谷類白粉菌中克隆的無(wú)毒基因，這兩個(gè)基因?qū)儆谝粋€(gè)含有1 350個(gè)旁系同源物的大家族，EKA（effector homologous to AVRk1 and AVRa10）基因家族。功能分析證明，它們能夠分別與大麥的Mlk1、Mla10互作，激發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)。相反，這兩個(gè)基因在感病品種中表達(dá)時(shí)，則會(huì)促進(jìn)病原菌的侵入[7]。這些結(jié)果反映出白粉菌無(wú)毒基因的雙重功能，即在非親和互作中的激發(fā)寄主免疫反應(yīng)功能和在親和互作中壓制寄主防衛(wèi)反應(yīng)的功能。最近，從Bgh中克隆了兩個(gè)無(wú)毒基因AVRa1和AVRa13，雖然它們?cè)谛蛄猩蠜](méi)有相關(guān)性，但都能分別被大麥等位基因Mla1和Mla13識(shí)別，說(shuō)明病原菌已經(jīng)進(jìn)化出用序列上完全不相關(guān)的無(wú)毒基因與序列上相似的R基因識(shí)別的互作模式[23]。

從Bgt中克隆的第一個(gè)無(wú)毒基因是對(duì)應(yīng)于小麥R基因Pm3a和Pm3f的AvrPm3a2/f2[21]。這個(gè)基因是一個(gè)典型的CSEP編碼基因。具有該基因的菌株能夠被Pm3a和Pm3f識(shí)別。除了這個(gè)基因參與了對(duì)無(wú)毒性的控制之外，還存在著一個(gè)抑制基因（suppressor，Svr）對(duì)AvrPm3a2/f2起調(diào)控作用。當(dāng)Svr基因起作用時(shí)，AvrPm3a2/f2表達(dá)水平不足以滿足其與R基因識(shí)別，因此也不足以激發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)。相反，當(dāng)Svr基因突變?yōu)闆](méi)有功能的svr基因時(shí)，足量的AvrPm3a2/f2才能完成與R基因的互作，誘導(dǎo)寄主抗病反應(yīng)。這種模式使得病原菌在不改變無(wú)毒基因序列的情況下，也能夠通過(guò)另外一個(gè)基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，逃避其與R基因的識(shí)別，從而增強(qiáng)了病原菌的適應(yīng)性[8]。而且，這一互作模型證明多個(gè)基因參與了AvrPm3與Pm3的互作，不僅豐富了基因?qū)驅(qū)W說(shuō)的內(nèi)容，而且說(shuō)明了病原菌無(wú)毒基因與寄主R基因互作的復(fù)雜性。

最近，我們與瑞士蘇黎世大學(xué)Beat Keller教授的研究團(tuán)隊(duì)合作，從Bgt中克隆了另一個(gè)無(wú)毒基因AvrPm2。它編碼的蛋白N端含有21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，其信號(hào)肽下游具有保守的YFWxC基序，同時(shí)還含有卵菌的RxLR基序，具有典型CSEP的特征，能夠與Pm2識(shí)別并激發(fā)寄主細(xì)胞HR反應(yīng)[24]。AvrPm2在結(jié)構(gòu)上與已知的RNase類核糖核酸酶具有同源性，如大麥白粉菌BEC1011（Bgh effector candidate）和BEC1054。BEC1011參與抑制寄主細(xì)胞HR反應(yīng)[25]，BEC1054則能夠與多個(gè)大麥蛋白互作，且對(duì)于吸器的形成是必需的。這兩個(gè)效應(yīng)子都參與了Bgh對(duì)大麥的致病過(guò)程[26]。這些結(jié)果說(shuō)明AvrPm2可能也具有像AVRa10和AVRk1那樣的雙重功能。而且，RNase類核糖核酸酶可能是禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的另一大來(lái)源。

3 禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的變異

在寄主R基因施加的選擇壓力下，病原菌會(huì)通過(guò)無(wú)毒基因的變異產(chǎn)生對(duì)含有相應(yīng)的R基因植株表現(xiàn)親和的菌株。從目前已知的白粉菌無(wú)毒基因中，我們發(fā)現(xiàn)在無(wú)毒菌株與毒性菌株之間至少存在4種變異類型：?jiǎn)蝹€(gè)氨基酸突變、連續(xù)氨基酸突變、插入突變和基因缺失。Bgt對(duì)Pm2的表型改變是由于AvrPm2所在基因組區(qū)域的12 kb的大片段缺失造成的。大片段的缺失可能是與旁側(cè)copia轉(zhuǎn)座子的同源重組事件有關(guān)。而且，在禾谷類白粉菌的另外兩種?；停邴湴追劬鶥.graminis f.sp. secalis和小黑麥白粉菌B.graminis f.sp. triticale中，保守的AvrPm2等位基因也存在類似12 kb的缺失[24]。這反映出無(wú)毒基因與其寄主R基因的協(xié)同進(jìn)化關(guān)系。比較無(wú)毒菌株與毒性菌株的AVRk1序列發(fā)現(xiàn)三種變異：1）點(diǎn)突變導(dǎo)致蛋白提前終止;2）核苷酸插入導(dǎo)致移碼突變;3）連續(xù)多個(gè)氨基酸的突變。AVRa10的序列變異包括單個(gè)氨基酸的改變和單個(gè)堿基插入導(dǎo)致的移碼突變[7]。小麥白粉菌AvrPm3a2/f2在毒性菌株中由于兩個(gè)氨基酸的差異而不能被Pm3a和Pm3f識(shí)別[21，27]。Bgh的AVRa1的點(diǎn)突變還有能夠?qū)е聼o(wú)毒基因功能喪失的例子[23]。另外，Bgh對(duì)Mla13親和的毒性菌株要么通過(guò)無(wú)毒基因AVRa13提前終止，要么通過(guò)基因3′端一段連續(xù)的氨基酸突變來(lái)獲得毒性[23]。以上這些變異類型在其他真菌無(wú)毒基因中均有報(bào)道。例如，油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculans的AvrLm1以及稻瘟病Magnaporthe oryzae的AVR-Pia、AVR-Pii和AVR-Pik/km/kp[28-29]。稻瘟菌對(duì)Pib的毒性不僅可以通過(guò)AvrPib的點(diǎn)突變、基因缺失（或片段缺失）來(lái)獲得，而且可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子的插入來(lái)實(shí)現(xiàn)[30]。盡管白粉菌無(wú)毒基因的變異與轉(zhuǎn)座子等重復(fù)序列密切相關(guān)，但目前還沒(méi)有在白粉菌中發(fā)現(xiàn)由于轉(zhuǎn)座子插入帶來(lái)的毒性變異。除上面提到的AvrPm2之外，Bgh無(wú)毒基因AVRa10和AVRk1所在基因家族的成員均與I型長(zhǎng)散布核原件（long interspersed nuclear elements， LINE-1）反轉(zhuǎn)座子家族（TE1a）共進(jìn)化，新的變異類型可能從大量的與AVRa10和AVRk1同源的基因中進(jìn)化而來(lái)[31]。

4 禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的克隆方法

截至目前，在禾谷類白粉菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的無(wú)毒基因（位點(diǎn)）中，絕大多數(shù)是通過(guò)圖位克隆的方法鑒定的[8]。這種經(jīng)典的遺傳學(xué)方法在沒(méi)有基因組序列的時(shí)代發(fā)揮了重要作用。但是，在沒(méi)有參考基因組的情況下，由于重復(fù)序列的存在，通過(guò)在很寬的連鎖標(biāo)記區(qū)域進(jìn)行染色體步移來(lái)獲得無(wú)毒基因并不是十分高效。禾谷類白粉菌基因組序列的公布[11，13]為白粉菌基因的克隆和功能解析提供了非常實(shí)用的工具，顯著提高了白粉菌無(wú)毒基因克隆的速度。AvrPm3a2/f2是第一個(gè)被克隆的小麥白粉菌無(wú)毒基因，該基因的克隆采用了二代測(cè)序技術(shù)和高通量基因型鑒定技術(shù)相結(jié)合的策略，大大提高了圖位克隆的效率[21]。近年來(lái)，由于測(cè)序通量的提高和成本的降低，為組學(xué)分析技術(shù)在無(wú)毒基因鑒定中的應(yīng)用帶來(lái)了更大的空間。Praz等利用來(lái)自不同地區(qū)60個(gè)菌株的基因組序列，進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，成功克隆了AvrPm2[24]。這一套數(shù)據(jù)可以用于多個(gè)無(wú)毒基因的篩選和克隆，避免了重復(fù)構(gòu)建雜交群體的工作。最近的AVRa1和AVRa13候選基因的克隆也采用了基于測(cè)序獲得的SNP關(guān)聯(lián)分析法，不同的是，SNP數(shù)據(jù)是來(lái)自對(duì)侵染葉片轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序[23]?？紤]到大多數(shù)效應(yīng)子基因在吸器中表達(dá)，這種策略有效地縮小了篩選范圍，而且減少了其他基因和不表達(dá)的效應(yīng)子基因的干擾。然而，白粉菌基因組含有大量的重復(fù)序列，這些序列的存在給無(wú)毒基因的克隆帶來(lái)困難[11，32]。在未來(lái)的研究中，利用自然群體和雜交群體的多組學(xué)數(shù)據(jù)，直接靶向編碼基因的分析策略將使得無(wú)毒基因的克隆變得更加高效。

5 展望

雖然禾谷類白粉菌無(wú)毒基因的研究在最近幾年取得了顯著的進(jìn)展，但還有很多方面需要進(jìn)一步闡明。LINE-1類無(wú)毒基因AVRa10和AVRk1具有與轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列密切相關(guān)的序列特征[31]，這類無(wú)毒基因編碼產(chǎn)物是如何分別與Mla10、Mlk1互作，激發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的？ AvrPm2編碼的Avr蛋白在序列上和結(jié)構(gòu)上與RNase相似，且能夠激活Pm2介導(dǎo)的寄主細(xì)胞HR反應(yīng)[24]，但仍然沒(méi)有明確兩者之間的互作是直接的還是間接的。這是因?yàn)锳vrPm2與Bgh的AVRa13在序列上具有相似性，但是Pm2與Mla13在序列上卻沒(méi)有相似性。如果發(fā)生直接的互作，那么這些序列上沒(méi)有相關(guān)性且來(lái)源于不同寄主的R蛋白是如何被序列上相似的Avr蛋白識(shí)別的？ 可能的解釋是AvrPm2和AVRa13均能夠與寄主中1個(gè)保守的警衛(wèi)蛋白（guardee）互作，且這個(gè)蛋白的變化能夠被Pm2和MLA13監(jiān)視。那么這些蛋白是如何行使其功能的，與Pm2之間是如何識(shí)別的還有待研究。對(duì)AvrPm3a2/f2起調(diào)控作用的基因Svr編碼一個(gè)效應(yīng)子，與已知的調(diào)控蛋白（例如轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)蛋白等）沒(méi)有序列相似性[21]，那么這個(gè)基因是如何調(diào)節(jié)AvrPm3a2/f2的表達(dá)量的？下一步采用生物化學(xué)方法對(duì)這些蛋白進(jìn)行深入的研究將有助于加深從分子層面了解無(wú)毒基因與R基因之間的互作機(jī)制。另外，盡管可以利用基因槍轉(zhuǎn)化方法對(duì)基因進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證，但仍然費(fèi)時(shí)耗力，建立高效穩(wěn)定的白粉菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系將助力無(wú)毒基因的遺傳驗(yàn)證。

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