萬婧驚 王青華 唐旭 黃仕新 徐長(zhǎng)安

摘要：如何充分利用水產(chǎn)加工廢棄物資源越來越受到重視。文章利用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗蛋白制備魚鱗蛋白多肽。通過考察溫度、時(shí)間、酶量、料液比等單一因素對(duì)水解魚鱗蛋白的影響，確定并設(shè)計(jì)了L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素和水平，最終獲得了中性蛋白酶酶解魚鱗蛋白優(yōu)化工藝條件，即酶量4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），溫度45℃，時(shí)間3h，料液比10%。在此條件下，酶解所得水解度為28.9%。與文獻(xiàn)比較，該工藝條件下水解時(shí)間大大縮短。該條件所得蛋白肽段的分子量主要分布在l-6KDa范圍內(nèi)。由此可見，該優(yōu)化條件適合規(guī)?；a(chǎn)，所得蛋白肽可以滿足食品、化妝品行業(yè)的需求。

關(guān)鍵詞：中性蛋白酶;海洋魚鱗;蛋白水解;條件優(yōu)化

魚鱗是魚真皮層的變形物，占魚體總重的3%～5%，含有豐富的蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)，魚鱗總重的41%—55%的有機(jī)物中，90%以上為膠原蛋白和魚鱗硬蛋白。

中醫(yī)自古以來就有使用魚鱗胨治療婦科疾病的歷史。隨著現(xiàn)代科學(xué)以及現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)的發(fā)展，魚鱗作為營(yíng)養(yǎng)和食療皆優(yōu)的佳品，越來越受到關(guān)注。魚鱗中含有的豐富膠原蛋白被低溫提取作為生物醫(yī)用材料原料，具有促進(jìn)神經(jīng)再生、創(chuàng)口愈合等功能。其水解產(chǎn)物中也含有大量的活性肽成分，具有促進(jìn)皮膚新陳代謝、延緩皮膚衰老、預(yù)防治療骨關(guān)節(jié)疾病、降血壓、抗血脂等功效，市場(chǎng)應(yīng)用前景十分廣闊。

中國(guó)是人口與資源大國(guó)，漁業(yè)和水產(chǎn)加工發(fā)達(dá)，但加工廢棄物并沒有得到充分利用，每年僅淡水魚鱗廢棄量就達(dá)到了30萬噸/年。對(duì)其進(jìn)行合理加工利用，既節(jié)約資源、保護(hù)環(huán)境，又可進(jìn)一步延伸拓展低值水產(chǎn)加工資源向高值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化的循環(huán)經(jīng)濟(jì)技術(shù)鏈。

膠原肽的制備方法主要包括化學(xué)水解法和生物酶水解法等。前者是利用酸或堿水解膠原蛋白，雖然方法簡(jiǎn)單、成本低廉，但水解過程中能破壞氨基酸，營(yíng)養(yǎng)損失大，產(chǎn)物復(fù)雜，且產(chǎn)生的廢水多，生產(chǎn)周期長(zhǎng);后者具有水解效率高、條件溫和、易于控制水解進(jìn)程等優(yōu)點(diǎn)。廣泛使用常用的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。中性蛋白酶也被用來水解水產(chǎn)品，張其標(biāo)等人使用中性蛋白酶水解鰱魚肉糜獲得較優(yōu)的水解條件，與酸性蛋白酶相比可以獲得更多的氨基酸;肖安風(fēng)等人應(yīng)用中性蛋白酶水解巴浪魚，水解10個(gè)小時(shí)獲得較高水解度。但使用中性蛋白酶水解魚鱗蛋白報(bào)道較少，而且耗時(shí)較長(zhǎng)。李春美等人將中性蛋白酶應(yīng)用于魚鱗的酶解反應(yīng)中，經(jīng)7小時(shí)后發(fā)現(xiàn)魚鱗消失，水解完成。為適合規(guī)?；a(chǎn)需要，文章采用4因素3水平（L9（34））正交實(shí)驗(yàn)，利用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗.優(yōu)化酶解工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美國(guó)紅魚魚鱗（Sciaenops ocellatus）：購(gòu)白福建東山，經(jīng)洗滌、脫脂和脫鈣處理后干燥備用;中性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司，酶活力20萬U·g-l;化學(xué)試劑：購(gòu)自西隴化工有限公司，其中碳酸氫鈉為食品級(jí)，其他均為分析純。凝膠色譜蛋白對(duì)照品，購(gòu)自Sigma，名稱（分子量），Superd-ex 200：Thyroglobulin （669KDa），F(xiàn)erritin （440KDa），BSA （67KDa），β-Lactoglobulin （35KDa），Cytochrome（13.6KDa），Aprotinin （6512）;Superdex peptide：Cytochrome C（12.5KDa），Aprotinin （6512），Vitamin B12（1355），Gly-Gly-Gly （189），Glycine （75）。

1.2 儀器

電子天平：METTLER TOIJFDO AL104型;烘箱：上海恒一科學(xué)儀器公司，DHG-9240A型;酶標(biāo)儀：美國(guó)分子儀器公司，SpectraMax M5型;pH計(jì)：Sartorius PB-10型。凝膠色譜柱：美國(guó)GE公司，Superdex 200 10/300 GL，柱體積23.56 mL;Su-perdex peptide 10/300 GL，柱體積23.56 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)工藝流程

脫脂、脫鈣干魚鱗一稀碳酸氫鈉溶液浸泡一蒸餾水清洗并調(diào)至中性一加熱預(yù)處理lOmin一調(diào)pH一酶水解一滅酶一測(cè)定水解度

1.3.2 分析方法

1.3.2.1 總蛋白含量：微量凱氏定氮法。

1.3.2.2 水解液游離氨基酸總量：茚三酮顯色法。

1.3.2.3 水解度的計(jì)算

DH=xl00%

1.3.3 單因素對(duì)酶解效果的影響

分別稱取備用的魚鱗4份，預(yù)處理后調(diào)整體積以及pH至6.0，加入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用量的中性蛋白酶，在實(shí)驗(yàn)溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時(shí)間或測(cè)定水解度，用以考察酶用量、溫度、料液比和時(shí)間對(duì)酶解效果的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量對(duì)魚鱗水解速度的影響

取4份5.0 g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經(jīng)預(yù)處理后，分別加入0.05，0.1，0.2，0.3g中性蛋白酶，根據(jù)作者前期工作結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道，調(diào)pH至6.0左右，于50℃酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時(shí)間，考察酶量對(duì)水解效果的影響，結(jié)果見圖l。

由圖l可看出.酶解時(shí)間隨著酶量的增加而呈降低趨勢(shì)，而酶量從0.2g增加到0.3g時(shí)，水解時(shí)間對(duì)酶量曲線的斜率變小，二者水解時(shí)間幾乎沒有相差，表明如果酶量再增加的話，其對(duì)酶解的影響將逐漸減小，可能是由于酶量的增加，蛋白中的肽鍵大量斷裂，也產(chǎn)生不少氨基酸或副產(chǎn)物，對(duì)酶活性部位不同程度地產(chǎn)生抑制作用，使得蛋白酶的酶促作用有所下降。同時(shí)，隨著酶用量的增加，0.2g到0.3g，酶解時(shí)間縮短的幅度減小情況下，成本增加了50%。因此，從經(jīng)濟(jì)成本角度考慮，確定酶用量0.2g，即4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）。

2.2 溫度對(duì)魚鱗水解速度的影響

取4份5.0g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經(jīng)預(yù)處理后，分別加入0.2 g中性蛋白酶，調(diào)pH 6.0，分別于30，40，50，60℃進(jìn)行酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時(shí)間，考察溫度對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果見圖2。

在圖2中，在實(shí)驗(yàn)的設(shè)定范圍內(nèi)隨著反應(yīng)溫度的增加，從30℃升至40℃時(shí)，酶解完成時(shí)間基本不變，為4h左右。當(dāng)溫度為50℃時(shí)，水解時(shí)間迅速變短至最低，之后溫度上升，酶解完成時(shí)間反而變長(zhǎng)。反應(yīng)溫度較低時(shí)，反應(yīng)體系粘度大，底物分子與酶分子相互接觸較為困難。故反應(yīng)速度較慢：隨著反應(yīng)溫度的上升，溶液的粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)的速度加快，底物分子中的反應(yīng)鍵或基團(tuán)與酶的活性部位相接觸的機(jī)會(huì)大大增加，酶活增強(qiáng)，反應(yīng)速度增大，至50℃時(shí)，酶活性最佳。此后，當(dāng)溫度再升高至60℃時(shí)，由于升高溫度引起的酶熱失活增加，從而降低了酶的有效濃度，反應(yīng)速度又呈下降趨勢(shì)。故選取50℃為酶水解溫度最適水平參考點(diǎn)。

2.3 料液比對(duì)酶解的影響

分別取1.0， 5.0，10.0，15.0g魚鱗，加入50mL水經(jīng)預(yù)處理后，加入0.2g中性蛋白酶，調(diào)pH6.0，于50℃進(jìn)行酶解，觀察并記錄魚鱗完全水解所需時(shí)間，考察料液比對(duì)酶解效果的影響，結(jié)果見圖3。

在恒溫水解反應(yīng)過程中，動(dòng)力學(xué)參數(shù)a值是一個(gè)跟初始蛋白酶濃度與初始底物濃度的比值.由圖3可以看出，固定初始中性蛋白酶的濃度，酶解效率隨著料液比的增加而降低，符合該動(dòng)力學(xué)模型。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的4個(gè)條件中，料液比為20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）和30%時(shí)反應(yīng)速度都比較慢，所用時(shí)間都比較長(zhǎng)，。當(dāng)濃度較高時(shí)，反應(yīng)體系粘度大，底物分子與酶分子相互接觸較為困難，故反應(yīng)速度較慢;隨著料液比的降低，溶液的粘度下降，分子運(yùn)動(dòng)所受的阻力減小，速度加快，底物分子中反應(yīng)鍵或基團(tuán)與酶活性部位相接觸的機(jī)會(huì)大大增加，反應(yīng)速度增大。雖然料液比為5%與10%時(shí)的速度比較快而且相當(dāng)，但是溶液過稀也會(huì)大大增加生產(chǎn)成本。因此，綜合考慮10%為參考點(diǎn)。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

取4份5.0g處理備用的干魚鱗，按料液比為1：10經(jīng)預(yù)處理后，加入0.2g中性蛋白酶，調(diào)pH6.0，于50℃進(jìn)行酶解.酶解時(shí)間分別為2，2.5，3，3.5小時(shí)，測(cè)定魚鱗蛋白的水解度以考察酶解時(shí)間的影響，結(jié)果見圖4。

圖4結(jié)果顯示，酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響較小。當(dāng)水解時(shí)間增加，水解度隨之上升，但幅度不大。當(dāng)酶解時(shí)間為3-3.5h時(shí)，水解度不再隨反應(yīng)時(shí)間而變化，基本保持不變。推測(cè)可能是由于反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，水解產(chǎn)物中的某些氨基酸殘基逐步占據(jù)了中性蛋白酶的活性部位，產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，致使水解反應(yīng)無法再繼續(xù)進(jìn)行，故確定3h為最適水解時(shí)間水平參考點(diǎn)。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以溫度、酶用量、料液比、酶解時(shí)間為因素設(shè)計(jì)4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34），進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝條件。

根據(jù)表2結(jié)果，極差大小的順序?yàn)榱弦罕?gt;酶用量>時(shí)間>溫度。極差愈大，對(duì)結(jié)果的影響也越大，因此料液比對(duì)酶解的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他三者。由此結(jié)果可以得出中性蛋白酶酶解魚鱗的最佳水解條件為A1B2C1D2，即酶用量4%，溫度45℃，料液比10%，時(shí)間為3h。該條件與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相比，大大減少了酶解時(shí)間，可能是由于適當(dāng)提高了酶用量以及適當(dāng)降低了料液比，使得蛋白酶可以與底物更加充分接觸，增加了碰撞的機(jī)會(huì)，從而加速反應(yīng)，大大縮短了時(shí)間，提高了酶解效率，同時(shí)也降低了酶解溫度，較好的控制了苦味肽的釋放。

用上述優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，做三份平行，最終水解度平均值為28.9%。

2.6 魚鱗蛋白肽分子量分布

將2.5中條件下水解獲得的魚鱗蛋白肽酶解液稀釋5倍，自動(dòng)進(jìn)樣，Superdex凝膠柱分離，與標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)照品比對(duì)，檢測(cè)分析在該條件下水解所得蛋白肽的分子量分布，結(jié)果見圖5和圖6。實(shí)線為樣品峰.虛線為蛋白對(duì)照品的峰。

凝膠色譜法主要用于高聚物的相對(duì)分子質(zhì)量分級(jí)分析以及相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)試，目前已被廣泛用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)以及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域。魚鱗蛋白基本上是由膠原蛋白和硬蛋白組成，這兩種蛋白均是結(jié)構(gòu)蛋白，分子量都大于300 KDa。

實(shí)驗(yàn)中使用Superdex 200和Superdex pep-tide兩種凝膠柱進(jìn)行分離分析。前者填料的顆粒較粗，適用于分子量較大的蛋白分離，由圖5可知，魚鱗蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶水解后，大分子量區(qū)域呈平直的基線水平，說明原料幾乎全部被分解成10 KDa以下的片段。后者填料顆粒相對(duì)較小，從圖6結(jié)果可以看出，魚鱗蛋白水解后肽段分子量分布主要集中在第2和第3個(gè)峰之間，即1-6Ku范圍內(nèi)。從譜圖中多肽的分子量分布來看，中性蛋白酶能夠?qū)Ⅳ~鱗蛋白很好地水解，所得的蛋白肽段的大小比較合適，適合食品及化妝品行業(yè)的需求。如果水解度過高，芳香族等疏水基團(tuán)將暴露出來，會(huì)造成苦味肽大量產(chǎn)生。

3 結(jié)論

文章采用中性蛋白酶酶解海洋魚鱗蛋白，通過對(duì)酶解反應(yīng)影響因素的單因素考察以及L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得了優(yōu)化條件，即溫度45℃、酶用量4%、料液比10%和時(shí)間3h。比文獻(xiàn)報(bào)道大大縮短了酶解時(shí)間，降低了酶解溫度，提高了酶解效率。通過酶解產(chǎn)物分子量分布分析，在上述優(yōu)化的條件下，中性蛋白酶可以很好地將魚鱗蛋白水解成1-6KDa大小的肽段.適合食品和化妝品行業(yè)的需求。

以資源豐富的海洋魚鱗蛋白制備一系列多肽產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域，橫跨化工業(yè)、食品行業(yè)、化妝品業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等。因此，該系列產(chǎn)品的開發(fā)有著美好的前景，可以真正地實(shí)現(xiàn)低值資源的“變廢為寶”高值化利用。

參考文獻(xiàn)（略）