慕慶峰, 于立紅, 張 濤, 賈洪柏, 吳慧云

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 寒地作物栽培技術(shù)省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江 大慶 163319;2.中海油能源發(fā)展股份有限公司 工程技術(shù)分公司, 天津 300452; 3.東北林業(yè)大學(xué), 生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040)

石油作為重要的化石能源為社會(huì)的發(fā)展提供了巨大的動(dòng)力，但是，自20世紀(jì)以來，石油污染帶來的問題日益突出[1]，石油進(jìn)入土壤后，會(huì)對土壤、植物、微生物、水體等產(chǎn)生直接或間接危害，如堵塞土壤孔隙，使土壤透水、透氣性降低，改變土壤有機(jī)質(zhì)的碳氮比和碳磷比，引起土壤板結(jié)[2]；進(jìn)入土壤的石油會(huì)附著在植物根系表面，影響根系的呼吸和吸收作用，抑制植物生長，并且大多數(shù)石油污染物具有致癌、致畸和致突變作用[3]，危害人類的身體健康。傳統(tǒng)處理油污土壤多采用的是熱解析、化學(xué)洗滌方法[4]，因費(fèi)用昂貴，產(chǎn)生二次污染，處理后土壤不能復(fù)墾等不足，難以規(guī)?；瘧?yīng)用。而微生物原位修復(fù)技術(shù)因其良好的修復(fù)效果，低廉的價(jià)格，無二次污染等特點(diǎn)越來越成為全世界有機(jī)污染修復(fù)的主流技術(shù)[5]。該技術(shù)通過優(yōu)化環(huán)境因素來加速自然生物降解進(jìn)程，是一種高效、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)可承受的綠色清潔修復(fù)技術(shù)[6]。其技術(shù)核心是獲得高效微生物及其影響因素之間的作用關(guān)系，尋找到最佳的組合方式，提高土壤中石油污染物的降解[7]。微生物作為環(huán)境修復(fù)的主體，其降解效率決定修復(fù)水平。提高降解率的第一要?jiǎng)?wù)是獲得高效石油降解菌[8]。因此篩選高效降解菌成為國內(nèi)外行業(yè)、學(xué)術(shù)界研究熱點(diǎn)。不同種屬微生物都有自己底物譜系，單一微生物很難獨(dú)立完成修復(fù)任務(wù)，特別是面對石油這種超級復(fù)雜有機(jī)物復(fù)合體，更需要偏利共生的高效微生物種群協(xié)同降解。因此開展高效協(xié)同菌種的篩選及其修復(fù)影響因素研究具有重要意義。本文針對大慶地區(qū)石油污染的土壤篩選馴化高效石油降解協(xié)同微生物菌群，并在室內(nèi)開展模擬試驗(yàn)，研究微生物原位修復(fù)的主要影響因素及水平(正交設(shè)計(jì))之間的關(guān)系，以期為石油污染場地生物修復(fù)工程的參數(shù)設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌 源

在大慶油田不同類型的油污地采集油污土壤，均勻混合，轉(zhuǎn)入塑料袋中，密封，4 ℃低溫保藏，用于菌種的篩選，石油樣品來自大慶油田采油一廠。

1.2 培養(yǎng)基

(1) 固體篩選培養(yǎng)基。石油20 g/L; NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;微量元素液8 ml; KH2PO45 g/L;瓊脂20 g/L;蒸餾水1 L;調(diào)整pH值至7.0～7.2。

(2) 增殖培養(yǎng)基。NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;KH2PO45 g/L;葡萄糖20 g/L;微量元素液8 ml;蒸餾水 1 L。

(3) 石油降解培養(yǎng)基。NH4Cl 6 g/L; K2HPO45 g/L;微量元素液8 ml，KH2PO45 g/L，蒸餾水1 L，石油1 g/L,pH=7.0～7.2。

(4) 微量元素液。MgSO44 g/L; MnSO410 g/L; FeSO4·7 H2O 10 g/L; CaCl210 g/L; ZnSO410 g/L;去離子水1 L。

1.3 菌株篩選

1.3.1 菌株初篩 稱取10 g油污土壤樣品，放入250 ml錐形瓶中，用生理鹽水定容至100 ml，放入10個(gè)玻璃珠，170 r/min振搖，待土壤分布均勻，取1 ml泥水混合液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，分別移取10-6，10-5，10-4倍的混合稀釋液0.5 ml至相應(yīng)編號(hào)的固體篩選培養(yǎng)基平板內(nèi)，用三角刮刀均勻涂布，倒置放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。觀察菌種生長情況，挑取長勢良好的菌落再次梯度稀釋，并接入到石油篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟，直到得到純培養(yǎng)的石油烴降解菌。純培養(yǎng)菌種4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 菌株的石油降解能力測定 將保藏菌株接入到增殖培養(yǎng)基中,30 ℃,140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，7 000 r/min離心，菌體以2質(zhì)量數(shù)接入到250 ml三角瓶中，每瓶含液體石油降解培養(yǎng)基(1.2.3)50 ml，30 ℃，140 r/min震蕩培養(yǎng)7 d后，加入20 ml石油醚(餾分30～60 ℃)萃取(重復(fù)3次)，合并有機(jī)相，并將水相7 000 r/min離心10 min，取上清液至分液漏斗，加入10 ml石油醚振蕩100次，靜置，待分層后收集合并總有機(jī)相，68 ℃蒸干，置干燥器中冷卻至恒重，稱重。不接菌的培養(yǎng)液為對照，按照下列公式計(jì)算石油降解率(μ)(3次重復(fù))。

μ=(W0-Wx)/W0×100%

(1)

式中：W0——對照液中殘余石油含量(%)；Wx——菌培養(yǎng)液中殘余石油含量(%)。

1.3.3 菌群的復(fù)配研究 石油是一種復(fù)雜的混合物，每種微生物只能降解特定的組分，優(yōu)勢微生物只能在特定時(shí)期在油污土壤環(huán)境中占據(jù)頂端優(yōu)勢，為提高石油降解率，研究復(fù)合菌群降解石油的協(xié)同能力至關(guān)重要[9]。試驗(yàn)選擇石油降解率高，在土壤擴(kuò)散能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行復(fù)配，測定7 d石油降解率。真菌生長環(huán)境偏酸、細(xì)菌偏堿，因此本次試驗(yàn)按照真菌間互作，細(xì)菌間互作，真菌細(xì)菌混作原則，等比例接入菌量，每個(gè)試驗(yàn)真菌按總濕菌量1 g接入，細(xì)菌則接入1 ml發(fā)酵液(提前調(diào)到1 012 cfm)。測定方法參照菌株的石油降解能力測定法，初始石油濃度1 g/L,(7 000 r/min離心發(fā)酵液獲得)，3次重復(fù)。

1.4 復(fù)合微生物菌群正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤的營養(yǎng)條件、含水率、pH值、石油的組分及濃度決定著土壤中微生物組成和數(shù)量的變化，后者直接關(guān)系到油污土壤的修復(fù)效果，為明晰其關(guān)系，試驗(yàn)選取5個(gè)因素：土壤石油污染強(qiáng)度；營養(yǎng)物(NH4NO3，K2HPO4)[10]；氧化劑(H2O2溶液)[11]；表面活性劑[12]和接菌量[13]，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平，比較不同因素影響下油污土壤的微生物修復(fù)效果，探求修復(fù)效果最好的外源補(bǔ)給方案，試驗(yàn)選在室內(nèi)進(jìn)行，溫度25 ℃，適當(dāng)補(bǔ)充水分，兩次重復(fù)。各因素及其水平列表L16(45)見表1。

培養(yǎng)條件：10 kg土壤放入50 cm×40 cm×35 cm的塑料箱中，土壤深度35 cm,用黑色塑料布封好

表面，定期翻整土壤。試驗(yàn)中,分別于第7，14，21，28，35，42，49 d對土壤進(jìn)行檢測，測定石油降解率。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)中獲得的菌種在土壤不同深度的生長狀態(tài)，將土壤分為上中下3層，每次取樣分別在上(0—10 cm)、中(11—25 cm)、下層(26—35 cm)隨機(jī)用土壤環(huán)刀等比例取土，樣品烘干、粉碎、混勻后通過4分法取土10 g，用石油醚萃取，然后測定和計(jì)算石油降解率。

表1 研究區(qū)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素及水平

注：表1中各因素不同水平劃分的標(biāo)準(zhǔn)為：A為原油占原土重的質(zhì)量百分比；B為原油/N/P的比例,其中N源為NH4NO3，P源為K2HPO4；C為H2O2占原土重的質(zhì)量比(g/kg)；D為表面活性劑占原土重的質(zhì)量百分比；E為接菌量(發(fā)酵液)占土重的百分比。下同。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解菌株的初篩

經(jīng)篩選馴化，共獲得16株原油降解效果好的菌株，3株真菌(DPF1，DPF2，DPF4)和13株細(xì)菌(DPB001-DPB013),其中DPB009為含油廢水中分離得到的菌株。參照1.3.2方法對所得菌株進(jìn)行石油降解率的測定，菌株形態(tài)特征及石油降解情況如表2所示。

表2 菌株形態(tài)特征及石油降解情況

2.2 降解菌群的復(fù)配

考慮到嗜油微生物在土壤中擴(kuò)散能力，選擇全部3株真菌(DPF1，DPF2和DPF4)和降解率最高的兩株細(xì)菌(DPB004和DPB009)進(jìn)行復(fù)合菌群協(xié)同試驗(yàn)，2株真菌(DPF2和DPF4)混合菌群的7 d石油降解率達(dá)到87.77%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通降油菌對石油類的降解率(40.3%～57.6%)[14]和海洋細(xì)菌對石油類的降解率(40.89%～62.75%)[15]。

向量的下標(biāo)和上標(biāo)分別表示向量的某個(gè)元素和該向量在某次迭代時(shí)的值,如xi和x(j)分別向量x的第i個(gè)元素和向量x在第j次迭代時(shí)的值.矩陣的下標(biāo)和上標(biāo)分別表示矩陣的行向量和列向量,如Ai和Aj分別表示矩陣A的第i個(gè)行向量和第j個(gè)列向量,而Aij則表示矩陣A的第i行第j列元素.向量x和矩陣A的轉(zhuǎn)置分別表示為xT和AT.向量x∈Rn的l2范數(shù)記為矩陣A∈Rm×n的Frobenius范數(shù)記為核范數(shù)記為其中r為矩陣A的秩,σi為其第i個(gè)奇異值.

如圖1所示，采用LSD法對各處理兩兩比較，真菌(DPF2和DPF4)比單一真菌DPF2試驗(yàn)組高5.88%，比真菌DPF4試驗(yàn)組高7.32%，說明真菌DPF2和真菌DPF4具有偏利共生，二者代謝底物有不重合域，不重合域越大，協(xié)同能力越強(qiáng)。細(xì)菌亦如此，對單一細(xì)菌DPB004試驗(yàn)組和DPB009試驗(yàn)組而言，兩株細(xì)菌混合試驗(yàn)組降解率更高，但是在搖瓶培養(yǎng)條件下細(xì)菌和真菌混合后的降解率不高，說明此降解條件下細(xì)菌和真菌的協(xié)同效果不理想?？紤]細(xì)菌在土壤中活動(dòng)受限制，在接下來的試驗(yàn)中主要研究這2株真菌的復(fù)合菌群對油污土壤的修復(fù)。

注：不同小寫字母表示在p<0.05水平下差異顯著，不同大寫字母表示在p<0.01水平下差異顯著。

圖1研究區(qū)微生物復(fù)配試驗(yàn)

2.3 復(fù)配菌系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

如表3所示，試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用5因素4水平正交設(shè)計(jì),共16個(gè)試驗(yàn)組。按照1.4方法定期取樣測定石油降解率，用SPSS軟件17.0分析所得數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示對7 d各試驗(yàn)組石油絕對降解量進(jìn)行分析如表4所示。

表3 研究區(qū)各采樣時(shí)間石油降解率 %

注：石油降解率=石油絕對降解量/初始油污土壤含油量×100%。

表4 研究區(qū)石油的7 d降解率SPSS分析

從表4結(jié)果方差分析,均值大的因素水平影響效果強(qiáng)，各因素水平對結(jié)果影響的強(qiáng)弱順序?yàn)?A2>A1>A2>A3,B1>B4>B3>B2,C4>C3>C2>C1,D4>D3>D1>D2,E4>E2>E3>E1。方差分析給出因素水平比較,在本次統(tǒng)計(jì)中,A，B，C，D，E5個(gè)因素都當(dāng)成了處理因素,這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)際上沒有考慮試驗(yàn)誤差，即表中Error 為0。在正交設(shè)計(jì)中，如果沒有重復(fù)試驗(yàn)，又無空白項(xiàng)時(shí)，常取因素離均差平方和(Ⅲ 型平方和)最小項(xiàng)作為誤差估計(jì)[16]。從表5中可以看出,A的Ⅲ 型平方和SSC=68.251最小,它對整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果影響最小,因而把它作為誤差估計(jì),用以檢驗(yàn)其他因素作用的顯著性。這樣重新進(jìn)行統(tǒng)計(jì),方法同上,只是不要將變量A添加參與到計(jì)算即可[17],結(jié)果見表4。

極差分析可知,因素的F值越大,其影響權(quán)重越高，各因素對試驗(yàn)結(jié)果的重要次序?yàn)?D>C>B>E>A,氧化劑(C)對石油降解率影響水平極顯著性，p<0.05水平，氧化劑(C)對石油降解率C1和C4影響水平極顯著，表面活性劑(D)在p<0.05水平，水平1水平2和水平4差異顯著，污染強(qiáng)度(A)、營養(yǎng)物(B)、接菌量(E)在7 d內(nèi)對石油降解率影響非常小,綜合各種因素,確定石油降解因素組合為D4C4B1E4A2。同理可得14，21，28，35，42，49，56 d的各因素重要次序和最佳工藝，見表5。

表5 研究區(qū)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)各因素重要性

對表5數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，為了清楚整個(gè)修復(fù)過程因素動(dòng)態(tài)變化，現(xiàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形化處理，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，因素重要性為縱坐標(biāo)。例如把因素的重要性分為5級，與排序相反，以7 d因素A為例，A重要級別為縱坐標(biāo),即為1同理因素D為5，畫折線圖?？紤]折線的平滑性以及因素的均值大小對表5因素重要性進(jìn)行校正，數(shù)據(jù)如圖2。

圖2 研究區(qū)各因素對生物修復(fù)的重要性

從圖2可知：因素A污染強(qiáng)度在0～7 d內(nèi)權(quán)重為1級，即對生物修復(fù)影響最小，8～28 d權(quán)重為3級，35～49 d權(quán)重最低降至1級。分析原因，微生物進(jìn)入土壤后，有一個(gè)生物延遲期，微生物調(diào)整底物代謝的酶系統(tǒng)。污染強(qiáng)度在0～28 d內(nèi)對降解率有影響。可見在一定條件內(nèi)，微生物可利用的石油組分越多，石油絕對降解量越大，但對整個(gè)修復(fù)期間降解率的影響不顯著。因素B營養(yǎng)物：在0～7 d內(nèi)權(quán)重3級，微生物處于生理延遲期，細(xì)胞需要緊急啟動(dòng)新底物代謝酶系統(tǒng)，因此對氮磷過量積累。而14～28 d,權(quán)重降為1級，可能跟土壤固有營養(yǎng)供給和前期過量吸收短時(shí)間需求量不大有關(guān)；土壤固有營養(yǎng)消耗殆盡后，外加補(bǔ)給作用更加明顯，因此35 d后權(quán)重升為4級。如圖2在整個(gè)修復(fù)過程，因素B水平2出現(xiàn)5/6次(扣掉微生物遲緩期第一星期)，所以因素B2為最佳比例。

氧化劑C在前21 d內(nèi)響應(yīng)指數(shù)一直為4級，28 d后權(quán)重升為5級，說明氧化劑C在整個(gè)修復(fù)過程中都具有重要影響，添加氧化劑在整個(gè)修復(fù)期內(nèi)都具有重要意義?？紤]H2O2是一次添加，7 d內(nèi)全部消耗掉了，因此只要不產(chǎn)生微生物生理毒性，氧化劑濃度大有好處，因此因素C4為最佳比例。

表面活性劑D在0～21 d權(quán)重為5級，影響最大，可見生物修復(fù)初期石油乳化效果對生物降解至關(guān)重要。28 d后權(quán)重降為1級，分析原因：初期外加表面活性劑促進(jìn)了微生物的增殖，后期大量生物表面活性劑的產(chǎn)生，降低了外源表活劑的權(quán)重。因此表面活性劑D4為最佳配比。

接菌量E在前42 d為2級，后期升級為3級，在整個(gè)修復(fù)期因素E水平均值差異不顯著，因此接菌量的多寡決定不了降解效果，即對降解率影響不顯著，因此E2比較適合。

3 討 論

根據(jù)圖2可知：在整個(gè)56 d降解期間內(nèi)，C因素氧化劑均占較大的權(quán)重，其對降解率影響最大。原因是化學(xué)氧化使大分子底物分解為小分子，提高了生物可降解率。但也有研究表明，氧化劑濃度過高會(huì)對微生物產(chǎn)生毒害作用[18]，因此氧化劑添加要有合適濃度，在本試驗(yàn)確定C4為適合氧化劑濃度。D因素表面活性劑具有增溶作用，石油為非極性物質(zhì)，具有疏水性，而微生物表面具有親水特性，添加的表面活性劑能增加石油與微生物之間的接觸機(jī)會(huì)，提高石油污染物質(zhì)的可利用性，縮短土壤修復(fù)時(shí)間；而本試驗(yàn)因素C在0～21 d內(nèi)權(quán)重最大，證明了上述觀點(diǎn)。隨著外加的表面活性劑被微生物降解[19]，其權(quán)重逐漸降低。到56 d時(shí)，D因素的權(quán)重已降至最小，證明表面活性劑大量被微生物消耗(表面活性劑一次性投入，不在不加)；另一方面到了降解后期微生物自身能夠大量產(chǎn)生生物表面活性劑，所以到了后期D因素對降解的影響權(quán)重自然變小。相比之下，E因素接菌量在整個(gè)修復(fù)期權(quán)重最小(除0～7 d延遲期)，推測其原因是微生物超強(qiáng)的自我繁殖能力，微生物數(shù)量的大量增殖，降低了因素E接菌量的影響，導(dǎo)致本試驗(yàn)微生物接菌濃度水平對于石油降解率影響很大，試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方差均值不顯著也證明了此觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

(1) 本試驗(yàn)從石油污染樣品中，以石油為唯一碳源進(jìn)行篩選、分離得到石油降解菌株16株，選取5株高效降解菌作進(jìn)一步協(xié)同試驗(yàn)。其中包含3株真菌(DPF1，DPF2，DPF4)和2株細(xì)菌(DPB004，DPB009)，這些株菌均能使石油乳化。經(jīng)復(fù)配研究，真菌(DPF2，DPF4)協(xié)同效果較好，7 d石油降解率可達(dá)87.77。

(2) 采用真菌(DPF2，DPF4)的復(fù)合菌群，設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn)室內(nèi)模擬微生物修復(fù)油污土壤的試驗(yàn)。結(jié)果表明，在56 d內(nèi)，石油污染強(qiáng)度為10的油污土壤降解率最高，達(dá)94.12%，石油污染強(qiáng)度為25的油污土壤，降解率為90.17%。

(3) 采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件17.0對降解過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在21 d內(nèi)，表活劑影響權(quán)重第一，氧化劑權(quán)重第2。21 d后氧化劑權(quán)重上升為第1，表活劑權(quán)重逐漸降低，營養(yǎng)劑則在28 d后上升至第2位置。石油烴污染強(qiáng)度僅在35 d前有一定權(quán)重(影響)，在修復(fù)后期影響最小。在整個(gè)修復(fù)過程，接菌量在所有因素中方差均值都最小，對降解率權(quán)重(影響)不大。