◎ 唐 薇，孫飛龍，曹卓松，楊 柳，寧景葉

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710048）

綠原酸是綠咖啡豆（又常稱生咖啡豆）的主要生物活性成分之一，是由咖啡酸與奎尼酸合成的一種苯丙素類物質(zhì)，易溶于水、醇和丙酮等溶劑[1]，具有抗氧化性、抗菌等生物活性，應(yīng)用于食品、藥品和日化等多個領(lǐng)域[2-3]。目前，從杜仲和金銀花中提取綠原酸常采用水或醇來浸提，耗材、耗時且提取率偏低，且利用表面活性劑提取綠原酸的研究甚少，所以本文利用表面活性劑聚乙二醇（PEG）用量少、增溶等性質(zhì)，相比傳統(tǒng)乙醇或者甲醇等較綠色，借助超聲波技術(shù)的空化和機械攪動作用進行提取[4-5]。本文利用超聲波提取法，從5種不同性質(zhì)溶劑中對比優(yōu)選出最佳提取劑及其濃度，并通過固液比、提取溫度、提取時間進行單因素和響應(yīng)面BBD法優(yōu)選提取最佳工藝，本課題對咖啡生豆中綠原酸的開發(fā)利用具有一定的研究價值和現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料

云南A級卡蒂姆咖啡生豆，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，SK5200LH超聲波清洗儀，722型可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝流程

咖啡生豆烘干、粉碎、過篩→咖啡粉→PEG400超聲提取→粗提液。

1.2.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取5 mg綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶解于1 mL的95%乙醇中，再用95%乙醇定容至100 mL，配成0.05 mg/mL工作液備用。吸取1、2、3、4 mL和5 mL工作液用95%乙醇定容至10 mL，用95%乙醇做對照，于328 nm處測吸光度。實驗重復(fù)3次，以綠原酸濃度為橫坐標(biāo)，平均吸光度值為縱坐標(biāo)，得到一元線性回歸方程y＝0.036 5x-0.006，R2＝0.999 8．其中，x為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）；y為綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值。

1.2.3 提取液中綠原酸含量的測定

從待測液中移取1 mL用95%乙醇稀釋后定容至10 mL，于328 nm處測吸光度，按式（1）計算綠原酸得率Y。

式（1）中，c為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的綠原酸濃度，μg/mL；n為稀釋倍數(shù)；v為配成溶液的體積，mL；m為咖啡粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 提取劑及其濃度的優(yōu)選

精密稱取1 g咖啡粉末于茄形瓶中，分別以20%、40%、60%、80% 4個不同濃度的甲醇、乙醇、PEG200、PEG400、PEG600為提取劑，在超聲波清洗儀中以液固比（mL/g）30∶1，溫度65 ℃，時間50 min條件下超聲提取，測抽濾后濾液的吸光度，平行實驗3組，計算綠原酸平均得率。

1.2.5 單因素實驗

按一定液固比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1）與40% PEG400混勻，在不同提取溫度下（50、55、60、65、70 ℃和75 ℃）超聲提取一定時間（20、30、40、50、60 min和70 min），靜置冷卻后抽濾，于328 nm處測濾液吸光度，計算綠原酸得率，分析不同因素的影響。

1.2.6 響應(yīng)面實驗

根據(jù)單因素實驗對液固比、提取溫度、提取時間進行3因素3水平響應(yīng)面分析，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計響應(yīng)面實驗，見表1。分析綠原酸在不同提取條件下的含量，從而優(yōu)化最佳提取條件。

表1 中心組合Box-Behnken因素水平表

1.2.7 實驗驗證

按照Design-Expert軟件中的Box-Behnken Design（BBD）模型優(yōu)化后所得的提取條件,做3組平行實驗，并計算得率。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑及其濃度的選擇

由圖1可得，5種提取劑相比PEG400提取率最大，隨著濃度增大，提取率先增大后減小，可能是由于黏度增大，極性減弱，不利于提取傳質(zhì)和溶質(zhì)溶出。PEG400濃度為40%時最高，因此選40%的PEG400為最佳提取濃度和提取劑。

圖1 不同提取劑對綠原酸得率的影響圖

2.2 單因素實驗

由單因素實驗得下圖2，65 ℃條件下，提取50 min，隨著液固比增大得率增大到30:1時最大，之后緩慢下降，這可能由于綠原酸大部分已溶出，再增加溶劑，其他物質(zhì)競爭增容位置，導(dǎo)致得率下降，因此液固比選擇30∶1較為合適；液固比30∶1，65 ℃條件下，時間越久，得率先緩慢增加，在50 min時得率最大，之后迅速下降，原因可能是時間越久，超聲波剪切作用更透徹，破壞了綠原酸分子結(jié)構(gòu)，也或者其他溶質(zhì)物質(zhì)析出，影響了綠原酸吸光度的測定，因此提取50 min時得率最大；液固比30∶1條件下，提取50 min，期間，可能由于溫度較高破壞了綠原酸的結(jié)構(gòu)造成得率先升后降，因此60 ℃提取得率最大。

2.3 響應(yīng)面實驗

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)Design-Expert8.0.6設(shè)計3因素3水平實驗得到二次回歸方程：Y=13.45-1.13A-0.083B-0.029C+0.14AB-0.17AC+0.41BC-1.33A2-0.71B2-0.45C2，

R2=0.9882，RAdj2=0.9371，CV=1.59%＜5%，說明模型擬合度和穩(wěn)定性好。方差分析見表2。

表2 回歸方程方差分析表

從表2得，模型P值＜0.000 1，則實驗所選的二次多項式模型在95%水平上有高度顯著性；失擬值P為0.800 8＞0.05，表示在95%水平上失擬不顯著，殘差由隨機誤差引起，即模型準(zhǔn)確可靠，方程擬合良好。表中A、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，因此，固液比的一次項，溫度和時間的交互項，固液比、時間和溫度的二次項對咖啡生豆中綠原酸的提取在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性大的影響。在所選因素水平范圍內(nèi)，影響綠原酸得率的因素順序是A＞B＞C。

2.3.2 響應(yīng)面3D Surface

響應(yīng)面3D Surface直觀反應(yīng)各因素交互作用對綠原酸得率的影響，曲面坡度越大，等高線越呈現(xiàn)橢圓形且越密，說明交互作用影響越大，由圖2可知，液固比對得率影響最大，溫度和時間次之，所選時間影響最小，這與方差分析結(jié)果相吻合。

圖2 各因素交互作用對綠原酸得率的影響圖

2.3.3 驗證試驗

根據(jù)二次多項式解得最佳工藝條件（修正后）：液固比28∶1，溫度60 ℃，時間50 min，咖啡生豆中綠原酸的得率是13.698 6 mg/g。平行3組實驗得到平均得率為13.68 mg/g，這與模型給出的預(yù)測值基本一致。

3 討論與結(jié)論

本實驗?zāi)康脑谟诓捎镁G色途徑高效優(yōu)化提取咖啡生豆中綠原酸的提取工藝，綠原酸廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥中，因此綠色提取工藝尤為重要。本文將常用提取劑甲醇、乙醇和不同分子量的表面活性劑PEG進行對比同時優(yōu)選了提取劑的濃度，比較綠原酸的得率，通過單因素和響應(yīng)面相結(jié)合，得到超聲波輔助提取綠咖啡豆中綠原酸最佳工藝條件：40% PEG400為提取劑，液固比28∶1，溫度60 ℃，時間50 min，得到得率為13.68 mg/g，由響應(yīng)面分析得影響得率的因素順序：液固比＞溫度＞時間。該提取工藝操作簡單，能耗少，得率高，為提取綠原酸提供一定參考價值。