林靜霞，王毅哲，梁人尹，劉 燁，丁沃娜，朱世華，鄭文娟*

(1 寧波大學 海洋學院，浙江寧波 315211；2 寧波大學 科學技術(shù)學院，浙江寧波 315212)

根系是水稻吸收水分、養(yǎng)分、固定和支持植株的器官，發(fā)達的根系對植株維持正常的生理功能及抵抗不良環(huán)境具有重要的作用。側(cè)根作為水稻胚后發(fā)育的重要器官，在水稻根構(gòu)型的建立中起著重要的作用，它能夠大幅度增加根系的吸收面積[1]。水稻的側(cè)根發(fā)生源自臨近原生韌皮部的中柱鞘細胞的分裂，研究表明側(cè)根發(fā)生的位置并不完全由遺傳因素決定，也受外界環(huán)境條件的影響。側(cè)根的數(shù)量、分布及發(fā)育狀況的好壞直接影響其對土壤中養(yǎng)分的吸收，從而改變植株在各種環(huán)境下的生長狀況，最終影響作物產(chǎn)量以及質(zhì)量[2]?，F(xiàn)階段對水稻的側(cè)根發(fā)育機制了解還很少，目前已經(jīng)報道了一些水稻側(cè)根發(fā)育相關(guān)突變體[3]，但經(jīng)過功能鑒定的主要是幾個水稻生長素途徑相關(guān)蛋白，如OsAUX1[4]、OsIAA3[5]、OsIAA11[6]、OsIAA13[7]、OsIAA23[8]和OsCYP2[9]等，整體上人們對水稻側(cè)根發(fā)生、發(fā)育的認識還不是很清楚。

溫度是影響水稻生長發(fā)育的最重要因素之一。目前，高溫已經(jīng)成為水稻產(chǎn)量的主要限制因素，隨著全球溫室效應的加劇，高溫脅迫危害水稻生產(chǎn)的問題愈發(fā)突出[10-11]。溫度過高或過低都會抑制水稻生長發(fā)育。高溫對水稻的影響不僅限于營養(yǎng)生長期，在其生殖期、花期都會產(chǎn)生不同程度的影響，而這些影響最終會造成株系不育[12]。溫度對水稻根系的影響，從作用程度上講，不及肥料與水分，但從功能上講，卻不容忽視。根際溫度影響著根系的生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)及根中各種代謝過程。溫度對水稻根系生長的影響主要表現(xiàn)在生長前期根系的形成和生長后期根系的衰竭。

k209是從EMS誘變的秈稻Kasalath突變體庫中篩選而來的一個對高溫敏感的側(cè)根缺失突變體。該突變體在正常條件下的株高、主根和不定根的表型與野生型Kasalath基本相同，但側(cè)根的數(shù)目與長度較野生型均有減少；在高溫條件下則與野生型有著顯著的區(qū)別，主要表現(xiàn)為地上部矮化，主根和不定根的伸長受到不同程度的抑制，最明顯的性狀表現(xiàn)為側(cè)根完全缺失。本研究在突變體k209表型鑒定和遺傳分析的基礎上進行了基因定位，最終將K209定位在4號染色體上，為該基因的克隆和水稻側(cè)根發(fā)育的分子機制研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 水稻材料與培養(yǎng)條件

水稻高溫敏感側(cè)根缺失突變體k209是由秈稻Kasalath經(jīng)EMS誘變后篩選得到。正常培養(yǎng)條件：光照12 h，相對濕度70%，白天32 ℃，夜晚22 ℃；高溫培養(yǎng)條件：光照12 h，相對濕度70%，34 ℃恒溫培養(yǎng)。水稻培養(yǎng)液的配方參照Yoshida等[13]。

1.2 表型分析

將野生型Kasalath和突變體k209的種子用蒸餾水沖洗干凈，以0.6%稀 HNO3破休眠處理16 h，37 ℃暗處催芽約2 d至露白。將露白的種子播于水稻培養(yǎng)液浮著的尼龍網(wǎng)紗上面，在正常和高溫條件下培養(yǎng)7 d后，用照相機(Nikon D70s)拍攝幼苗全株表型和根部性狀，用標尺測量株高、主根長和不定根長，用體式鏡(Leica MZ95，Germany)對根莖結(jié)合部、主根中段和根尖進行拍攝。對7 d苗齡的野生型Kasalath和突變體k209的主根進行亞甲基藍染色，并用體式鏡拍攝觀察側(cè)根原基。樣本統(tǒng)計數(shù)為20株，3次重復。

1.3 遺傳分析和定位群體的構(gòu)建

用純合突變體k209作為母本，野生型kasalath為父本雜交獲得F1個體。F1種子在34 ℃條件下恒溫生長7 d觀察其側(cè)根表型；F1自花授粉獲得F2群體，隨機選取F2群體的種子在34 ℃條件下生長7 d，統(tǒng)計野生型表型和突變體表型的分離比并進行χ2檢驗分析。突變體k209與粳稻Nipponbare雜交，F(xiàn)1自交獲得F2群體，其在34 ℃高溫條件下生長7 d后分離出來的側(cè)根缺失植株用于基因定位。

1.4 分子標記分析

1.4.1分子標記的選擇和設計用于基因定位的分子標記來自已公布的SSR序列(http://www.gramene.org/)，每條染色體按照20 cM的遺傳距離較均勻合理地選擇約10個SSR標記進行粗定位。根據(jù)已公布的粳稻Nipponbare全基因組序列信息RGP(http://rgp.dna.affrc.go.jp/E/toppage. html)和中國華大基因研究中心提供的秈稻品種9311全基因組序列比對，在有差異的序列兩側(cè)設計引物，檢測后選取在親本間條帶有差異的InDel標記對K209進行精細定位。InDel和SSR標記引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.2PCR擴增采用簡易TPS法[14]從水稻葉片中提取親本、F1和F2分離群體的DNA。利用PCR擴增篩選的分子標記，具體的擴增體系是：1 μL模板DNA、1 μL 10×PCR buffer、1.2 μL 25 mmol/L MgCl2、0.3 μL 2.5 mmol/L dNTP、0.3 μL 10 μmol/L上下游引物、0.1 μL 5 U/mLTaqDNA聚合酶、5.8 μL超純水。PCR反應條件是：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

配制聚丙烯酰胺凝膠，待膠凝固后，用3 μL PCR產(chǎn)物點樣，開始電泳跑膠。跑完P(guān)AGE膠后用0.1% AgNO3銀染10 min，清水洗凈后，再倒入400 mL顯色液顯色，直至膠呈現(xiàn)黑色條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的表型鑒定

兩種溫度環(huán)境下培養(yǎng)的野生型Kasalath和突變體k209的7 d幼苗表型觀察發(fā)現(xiàn)，k209在正常培養(yǎng)條件下，株高、主根長、不定根長均與野生型的基本相同(圖1, a、c)，但側(cè)根數(shù)目變少，只有野生型的64.19%(表1)；而在高溫培養(yǎng)條件下，k209出現(xiàn)了明顯的突變性狀，主要表現(xiàn)為側(cè)根缺失，此外幼苗株高變矮，為野生型的57.18%；主根和不定根的長度都變短，分別只有野生型的55.46%和44.07%，不定根數(shù)與野生型相比有所增加(圖1, b、d；表1)。在體式鏡下觀察根部各個部位的表型可知，正常培養(yǎng)條件下突變體k209的側(cè)根長度明顯變短，只有野生型的41.12%(圖2和表1)；在高溫條件下，k209的側(cè)根完全缺失(圖2)。

2.2 突變體側(cè)根原基發(fā)生分析

為了了解突變體k209高溫側(cè)根缺失的原因，對7 d苗齡的野生型Kasalath和突變體k209的幼苗主根進行了亞甲基藍染色觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常條件下，野生型和k209幼苗主根上均可以觀察到側(cè)根原基以及肉眼可見的側(cè)根，k209的側(cè)根原基數(shù)約為Kasalath的79.28%；在高溫條件下，Kasalath和k209幼苗主根上均可以觀察到側(cè)根原基，但k209側(cè)根原基數(shù)目明顯少于Kasalath，約為Kasalath的58.03%，且不能突破表皮長出側(cè)根(圖3和表2)。

2.3 遺傳分析

a．常溫培養(yǎng)下整株表型；b．高溫下整株表型；c．常溫培養(yǎng)下根系表型；d．高溫下根系表型。Bars=2 cm圖1 7 d苗齡的野生型Kasalath與突變體k209的表型a. Seedlings under normal temperature; b. Seedlings under high temperature; c. Roots under normal temperature; d. Roots under high temperature. Bars=2 cmFig.1 Phenotypic characteristics of 7-day-old wild type Kasalath and k209 mutant

溫度Temperature性狀 Trait Kasalathk209與Kasalath比較 Compared Kasalath WT/%常溫Normal temperature(32 ℃/22 ℃)株高Plant height/cm18.93±1.5918.61±1.42-1.69主根長Primary root length/cm14.95±0.7914.92±0.85-0.20不定根長Adventitious root length/cm5.27±0.505.89±0.4111.76不定根數(shù)Adventitous root number3.54±0.843.77±0.806.50側(cè)根長Lateral root length/mm9.07±0.123.73±0.17-58.88側(cè)根數(shù)Lateral root number197.33±10.66126.67±2.49-35.81高溫High temperature(34 ℃)株高Plant height/cm19.15±2.1610.95±1.09-42.82主根長Primary root length/cm13.27±0.607.36±0.34-44.54不定根長Adventitious root length/cm5.90±0.212.60±0.46-55.93不定根數(shù)Adventitous root number3.23±0.585.15±0.6659.44側(cè)根長Lateral root length/mm10.13±0.1700側(cè)根數(shù)Lateral root number188.33±3.4000

注：不定根長為最長3根不定根長度的平均值；側(cè)根長為最長3根側(cè)根長度的平均值

Note：Adventitious root length is the average length of three longest adventitious roots; Lateral root length is the average length of three longest lateral roots

圖2 7 d苗齡的野生型Kasalath與突變體k209的主根體視鏡照 (Bars=1 mm)Fig.2 The primary root of the 7-day-old wild type Kasalath and k209 mutant under stereoscope (Bars=1 mm)

圖3 7 d苗齡的野生型Kasalath和突變體k209主根側(cè)根原基的亞甲基藍染色Fig.3 Lateral root primordia stained with methylene blue on primary roots of 7-day-old wild type Kasalath and k209 mutant

2.4 突變體基因定位

選用粳稻Nipponbare和突變體雜交獲得的F2群體作為定位群體，提取30株F2側(cè)根缺失突變株的DNA，然后吸取等量DNA至離心管中構(gòu)建一個突變池。以突變池為模板，Kasalath、Nipponbare和F1為對照，用181對現(xiàn)有的SSR序列引物進行PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4號染色體上的物理位置為11 471 kb的分子標記RM16604處混合樣品基因型為野生型Kasalath，解包檢測結(jié)果為30個群體重組為零(圖4)，說明RM16604可能與K209基因連鎖。

表2 不同溫度條件下7 d苗齡的野生型Kasalath和

注：表中數(shù)據(jù)取3個不同主根上的側(cè)根原基數(shù)的平均值

Note: The average number of the LRPs of three primary roots

選用RM16604附近的SSR引物和設計新的InDel分子標記進行解包分析(表4)，同時不斷擴大F2突變?nèi)后w進行分析，RM16604和11408K分子標記處重組子數(shù)目為零。在7522K和11524K處分別檢測到重組子(圖5)，最終將K209基因定位在標記7522K和11524K之間，物理距離大約為4 002 kb，著絲粒正好位于此區(qū)間內(nèi)(圖6)。

3 討 論

植物側(cè)根形成是根系發(fā)育的關(guān)鍵因素，受多方面的影響。與地上部分側(cè)枝的形成相比，側(cè)根形成具有更多的不確定性[15]。現(xiàn)階段對禾谷類作物側(cè)根發(fā)育的研究還較為滯后，這在一定程度上給開展以根系優(yōu)良性狀為目標的作物育種等實際工作造成了困難。因此，對于水稻等禾谷類作物側(cè)根發(fā)生發(fā)育的過程和調(diào)控機理的研究極為重要。

表3 突變體k209的遺傳分析

1.Kasalath；2. Nipponbare；3. F1(k209×Nipponbare)；4～25. F2側(cè)根缺失單株圖4 與K209基因連鎖的SSR標記RM16604的擴增結(jié)果1. Kasalath; 2. Nipponbare; 3. F1(k209×Nipponbare); 4-25. Lateral rootless individuals in the F2 populationFig.4 Amplification of the SSR marker RM16604 linked with the K209 gene

引物名稱 Primer name上游引物(5′→3′)Forward sequence下游引物(5′→3′)Reverse sequence5304KGATGTCAAACACTCAAACCATCGTTCATCACTTTCTCCAACTCRM3471AGATCCCGACAGATGGTGACAACAGAGGGAGGGAGCAGAG7522KTGTGAGTTCTGATCCTTTATAACTTTTAACTTGTTCCGAG11408KACGGCAAGCGAAGGATTCTAATTTTGGTAGTAGGAAGTCTCTRM16604CGGTACATAATATACGGTCAGGATGCTGGGTATTGCCTAACTGCTTTCC11524KGTATCAATCGAATCCTCATGTCGGATAGACTGGCACTACT

1.Kasalath；2. Nipponbare；3. F1(k209×Nipponbare)；4～25. F2側(cè)根缺失單株；☆.重組單株圖5 標記7522K和11524K在Nipponbare/k209 F2群體中分離的部分擴增結(jié)果1.Kasalath; 2. Nipponbare; 3. F1(k209×Nipponbare); 4-25. Lateral root loss individuals in F2 population; ☆.RecombinantFig.5 Segregation of markers 7522K and 11524K in partial individuals of the Nipponbare/k209 F2 population

圖6 K209基因在水稻4號染色體上的分子定位示意圖Fig.6 Schematic diagram of the K209 gene mapped on rice chromosome 4

側(cè)根的發(fā)生大致可以分為起始、原基形成、分生組織形成以及活化等幾個關(guān)鍵時期[16]，內(nèi)在遺傳調(diào)控因子和外在環(huán)境因素共同決定谷物中側(cè)根的形成。近年來發(fā)現(xiàn)了一些與水稻側(cè)根生長發(fā)育相關(guān)的突變體，它們主要表現(xiàn)在側(cè)根伸長受限制以及側(cè)根密度降低。在大多數(shù)情況下，側(cè)根發(fā)生缺失的水稻突變體中其他類型的根也會表現(xiàn)出異常發(fā)育，這恰恰體現(xiàn)了谷類根系結(jié)構(gòu)中的復雜調(diào)控機制。本研究中的側(cè)根缺失突變體k209在正常培養(yǎng)溫度(晝32 ℃/夜22 ℃)下的株高、主根長、不定根長及不定根數(shù)與野生型相比差異不大，但側(cè)根的數(shù)目與長度均有減少；在高溫(34 ℃恒溫)條件下突變體幼苗表現(xiàn)為側(cè)根完全缺失，主根和不定根的長度變短，且株高變矮。通過亞甲基藍染色結(jié)果分析表明，在正常培養(yǎng)條件下，野生型和突變體k209的7 d苗齡主根上均能觀測到一定數(shù)量的側(cè)根原基以及突破表皮形成的側(cè)根；在高溫條件下，野生型和k209幼苗主根上均可以觀察到側(cè)根原基，但是k209的側(cè)根原基數(shù)目明顯少于野生型，且不能突破表皮長出側(cè)根?？梢?，高溫對k209的側(cè)根原基的發(fā)生和發(fā)育都有影響。

已有研究表明，生長素對側(cè)根發(fā)生發(fā)育的調(diào)控非常關(guān)鍵。在水稻中，編碼Aux/IAA蛋白的OsAUX1[4]、OsIAA3[5]、OsIAA11[6]、OsIAA13[7]和OsIAA23[8]基因突變都導致了其對應的突變體側(cè)根發(fā)生缺陷。OsAUX1基因位于1號染色體上，它參與生長素極性運輸，在調(diào)控生長素介導的水稻側(cè)根起始中發(fā)揮功能，aux1突變體主根變長，側(cè)根減少；OsIAA3基因位于12號染色體上，突變體iaa3表現(xiàn)在側(cè)根伸長受到抑制以及密度減少；OsIAA11基因位于3號染色體上，iaa11的側(cè)根原基萌發(fā)受到抑制；OsIAA13基因位于3號染色體上，iaa13突變體的側(cè)根密度降低；OsIAA23基因位于6號染色體上，與突變體iaa3表型類似，iaa23的側(cè)根伸長也受到抑制同時密度減少。此外，編碼親環(huán)素蛋白的OsCYP2/LRT2基因參與Aux/IAA蛋白降解從而調(diào)控側(cè)根發(fā)生，OsCYP2/LRT2基因位于2號染色體上，突變體cyp2和lrt2表現(xiàn)為對生長素不敏感，側(cè)根缺失[17-18]。

近年來在水稻中已篩選到一些與溫度相關(guān)的突變體，但和溫度相關(guān)的水稻側(cè)根突變體的報道還很少，與k209具有類似發(fā)生機制的突變體主要有hts1[19]和orc3[20]。對突變體hts1的初步研究表明，26 ℃時突變體hts1的側(cè)根表型正常，28～32 ℃時表現(xiàn)為少側(cè)根，34 ℃以上表現(xiàn)為無側(cè)根以及不定根數(shù)目顯著增加，目前還沒有該基因的定位報道。OsORC3基因位于10號染色體上，突變體orc3在26 ℃培養(yǎng)下側(cè)根正常發(fā)育，而在34 ℃高溫環(huán)境下表現(xiàn)為側(cè)根缺失，亞甲基藍實驗結(jié)果表明高溫條件下突變體orc3的側(cè)根原基發(fā)育正常，但最終無法突破表皮形成側(cè)根。

本研究中的水稻高溫敏感側(cè)根缺失突變體k209屬于隱性單基因突變。突變基因被定位在4號染色體的InDel標記7522K和11524K之間，目前該區(qū)間還沒有側(cè)根發(fā)育相關(guān)基因的報道，表明K209基因是一個調(diào)控側(cè)根發(fā)育的新基因。因此該基因的克隆和功能的深入研究有助于進一步揭示植物側(cè)根發(fā)育的分子機制。