劉志云，范軍秀，姚利飛，彭衛(wèi)，王偉，鄧茂林

(上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉安 343000)

近年來，質(zhì)量控制越來越受到醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的重視，根據(jù)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可（ISO15189）和美國(guó)病理協(xié)會(huì)（CAP）的要求，任何一個(gè)用于常規(guī)檢測(cè)的新系統(tǒng)或新項(xiàng)目在使用前必須進(jìn)行性能驗(yàn)證[1，2]。隨著分子生物學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)廣泛用于臨床，藥物基因檢測(cè)是本科室開展的重要檢測(cè)項(xiàng)目，其檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證是保證其檢測(cè)質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，根據(jù) 《CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[3]使用PCR-芯片雜交法對(duì)上海百傲生物科技有限公司生產(chǎn)的人類CYP2C9&VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確性、特異性、最低檢測(cè)限和抗干擾能力進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取上海市東方醫(yī)院吉安醫(yī)院2017年12月-2018年6月臨床擬用華法林但未使用任何溶栓藥物治療的53例患者，其中男33例，女 20 例，平均年齡（63.5±5.3）歲，臨床診斷明確。所有就診者無家族病遺傳史，無血緣關(guān)系。

1.2 主要試劑和儀器 全自動(dòng)核酸提取儀 （湖南圣湘生物科技有限公司）；人類CYP2C9&VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒（PCR-芯片雜交法，上海百傲生物科技有限公司）?？垢蓴_物物質(zhì)膽紅素(上海源葉生物有限公司；批號(hào)：20120322)；抗干擾物物質(zhì)膽固醇(上海將來實(shí)業(yè)有限限公司；批號(hào)：136036）；抗干擾物物質(zhì)甘油三酯 (上海將來實(shí)業(yè)有限限公司；批號(hào)：118624）。羅氏Cobas z 480 PCR擴(kuò)增儀，Baio全自動(dòng)雜交儀 （上海百傲生物科技有限公司），Baio BE-3.0生物芯片識(shí)讀儀 （上海百傲生物科技有限公司）。

1.3 DNA的提取和擴(kuò)增 采集所有研究對(duì)象靜脈血 2ml（EDTA-K2 抗凝，4℃保存），用全自動(dòng)核酸提取儀提取外周血DNA及純化，置-20℃保存?zhèn)溆?。按照上海百傲生物科技有限公司生產(chǎn)的人類CYP2C9&VKORC1基因檢測(cè)試劑盒的要求對(duì)代謝基因CYP2C9(*2C430T、*3A1075C)及受體基因VKORC1(G1639A)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用試劑盒自帶的質(zhì)控品做陰陽性對(duì)照。使用羅氏Cobas z 480擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，使用百傲基因芯片雜交儀進(jìn)行芯片雜交，使用百傲BE-3.0芯片識(shí)讀儀及其相應(yīng)軟件對(duì)雜交好的芯片進(jìn)行識(shí)讀并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性 隨機(jī)選取20例擬用華法林藥物的患者臨床樣本，按照人類CYP2C9&VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑說明書的要求進(jìn)行PCR-芯片雜交檢測(cè)，判斷其人類CYP2C9&VKORC1基因型，并將提取好的核酸樣本送至華大基因生物公司行雙向測(cè)序，兩方法學(xué)間結(jié)果比對(duì)符合率≥90%即正確度驗(yàn)證通過。本實(shí)驗(yàn)20例臨床標(biāo)本使用PCR-芯片雜交法和雙向測(cè)序比對(duì)結(jié)果符合率為100%，即本實(shí)驗(yàn)正確度驗(yàn)證通過。見表1。

表1 PCR-芯片雜交法和雙向測(cè)序法準(zhǔn)確性結(jié)果標(biāo)比對(duì)表

表2 PCR-芯片雜交法和雙向測(cè)序法特異性結(jié)果標(biāo)比對(duì)表

2.2 特異性 按照人類CYP2C9&VKORC1基因檢測(cè)試劑盒說明書要求，分別選取10例CYP2C9-430、CYP2C9-1075及VKORC1-1639野生型的基因（準(zhǔn)確度驗(yàn)證時(shí)通過雙向測(cè)序確定）共30例進(jìn)行PCR-芯片雜交，檢測(cè)其基因位點(diǎn)，并送至華大基因生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，每個(gè)野生型基因在兩方法學(xué)間的比對(duì)結(jié)果符合率≥90%即特異度驗(yàn)證通過。30例標(biāo)本使用PCR-芯片雜交法檢測(cè)的3個(gè)野生型基因結(jié)果及其測(cè)序結(jié)果均為野生型，兩方法學(xué)結(jié)果比對(duì)符合率為100%，本實(shí)驗(yàn)特異度驗(yàn)證通過。見表2。

2.3 最低檢出限 選取1例核酸濃度為25ng/μl、其基因型為CYP2C9*1/*2(*2CT/*3AA)&VKORC1-1639AA的臨床基因組DNA，用BE洗脫液倍比稀釋為 12.5ng/μl、6.25ng/μl、3.125ng/μl、1.563ng/μl及 0.78ng/μl。 選 擇 3.125ng/μl、1.563ng/μl 及 0.78ng/μl 3個(gè)濃度使用PCR-芯片法重復(fù)各檢測(cè)20次，按照各濃度標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與稀釋前結(jié)果比對(duì)的符合率≥85%為有效濃度，該最低有濃度為該檢測(cè)體系的檢測(cè)下限。選擇的3個(gè)濃度中3.125ng/μl、1.563ng/μl兩濃度的檢測(cè)結(jié)果與稀釋前的基因型一致，符合率為100%，而濃度為0.78ng/μl標(biāo)本的檢查結(jié)果與稀釋前的符合率只有30%，故該濃度應(yīng)該剔除。故本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)下限為1.563ng/μl。

2.4 抗干擾能力 取3例已知基因型的臨床標(biāo)本，基因型分別為 CYP2C9*1/*1(*2CC/*3AA)&VKORC1-1639AA，CYP2C9*1/*3(*2CC/*3AC)&VKORC1-1639AA，CYP2C9*1/*2(*2CT/*3AA)&VKORC1-1639AA。每例標(biāo)本分為10份，每份200μl，其中1份不添加任何干擾物，設(shè)為對(duì)照組，其余9份平均分為3組，每組分別加入甘油三酯、總膽固醇、總膽紅素，配制成濃度分別為47mmol/L、65mmol/L和34.2mmol/L的待檢標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果之間的符合率≥90%即抗該物質(zhì)干擾驗(yàn)證通過。按照血液基因組DNA提取的方法提取上述樣本血液基因組DNA，然后用CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性檢測(cè)試劑盒按照說明書方法測(cè)定上述3個(gè)基因型，每個(gè)樣本檢測(cè)2次，結(jié)果表明加入甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素標(biāo)本的基因型與對(duì)照組完全符合，符合率為100%，本實(shí)驗(yàn)抗干擾驗(yàn)證通過。

3 討論

CYP2C9是細(xì)胞色素P450酶（CYP）第二亞家族中的重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20%。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝，其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因那均為治療指數(shù)較窄的藥物[4-8]。CYP2C9活性變化可導(dǎo)致這些藥物體內(nèi)濃度出現(xiàn)較大變化，甚至導(dǎo)致嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。華法林是臨床上常用的抗凝藥物，是深靜脈血栓、心房纖顫、心臟瓣膜置換術(shù)和肺栓塞等疾病的一線用藥，其臨床療效和不良反應(yīng)存在很大的個(gè)體差異，血藥濃度過高或敏感性增加可導(dǎo)致嚴(yán)重出血事件[9-11]。心腦血管疾病已成為嚴(yán)重危害我國(guó)國(guó)民健康、特別是中老年人的一種常見病，具有高患病率、高致殘率，高死亡率的特點(diǎn)，其發(fā)病率位居我國(guó)首位。相關(guān)資料表明，目前，我國(guó)有超過2.9億心血管疾病的患者，每年因心血管疾病死亡的人數(shù)達(dá)300萬[12]，因此，對(duì)心血管疾病患者進(jìn)行合理用藥，延長(zhǎng)患者的生存質(zhì)量，越來越受到臨床重視。

近年來的，越來越多的藥物基因檢測(cè)技術(shù)用于臨床用藥指導(dǎo)。根據(jù)美國(guó)《臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)法修正案》和實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可的要求，實(shí)驗(yàn)室在開展常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之前，必需對(duì)重現(xiàn)其試劑說明書提供性能指標(biāo)[13]。本研究參照《CNAS-CL36醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說明》和江西省臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的相關(guān)規(guī)定，參考試劑說明書，結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況對(duì)準(zhǔn)確度、特異性、最低檢出限和抗干擾能力分析性能進(jìn)行驗(yàn)證。

準(zhǔn)確性是指試驗(yàn)中真陽性結(jié)果判斷為陽性的比例。本試驗(yàn)通過PCR-芯片雜交法檢測(cè)20例臨床樣本，同時(shí)將提取好的核酸送至華大基因生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將兩者結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)間的比對(duì)，本研究檢測(cè)的結(jié)果與華大基因的測(cè)序結(jié)果完全符合，表明準(zhǔn)確性符合廠商宣稱的要求，驗(yàn)證通過。

特異性是指試驗(yàn)中真陰性結(jié)果判斷為陰性的比例。對(duì)于基因突變檢測(cè)定性項(xiàng)目，將PCR-芯片雜交法檢測(cè)的野生型基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，如測(cè)序結(jié)果也為野生型則判為真陰性。本次試驗(yàn)中將10例CYP2C9&VKORC1野生型基因位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果均為野生型，與PCR-芯片雜交法檢測(cè)的結(jié)果一致，證明了本試劑盒的特異性良好，本次實(shí)驗(yàn)因標(biāo)本量不多，在今后的工作中隨著檢測(cè)標(biāo)本量的增多，可完善對(duì)特異性性能的評(píng)估。

最低檢出限是指檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)試劑的確定被分析物的最低濃度或量，是定性檢測(cè)項(xiàng)目的一個(gè)重要的分析性能。本次性能驗(yàn)證中，將提取純化好的基因組DNA稀釋倍比稀釋至1.56ng/μl，對(duì)稀釋最低陽性檢測(cè)標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)20次的結(jié)果與未稀釋前的結(jié)果完全一致，證明本次性能驗(yàn)證的最低檢出限能比試劑廠家聲明的最低檢出限更低。

抗干擾能力是指檢測(cè)結(jié)果不受標(biāo)本中黃疸、脂血和溶血現(xiàn)象影響的能力。本次研究中，分為3組，分別加入甘油三油、膽固醇、總膽紅素，配制成濃度分別為47mmol/L甘油三酯、65mmol/L膽固醇和34.2mmol/L總膽紅素的待檢標(biāo)本，這三個(gè)均為試劑說明書表明的最高濃度，每組檢測(cè)3次，進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與對(duì)照結(jié)果完全符合，表明試劑的抗干擾能力良好。在實(shí)際檢測(cè)過程中，標(biāo)本的還可能存在其它的干擾物質(zhì)如嗜異性抗體的干擾，有條件的實(shí)驗(yàn)室可進(jìn)行更多的抗干擾能力的驗(yàn)證。

綜上所述，對(duì)一個(gè)新的檢測(cè)系統(tǒng)或項(xiàng)目進(jìn)行性能驗(yàn)證，是保證檢測(cè)質(zhì)量的基礎(chǔ)。本研究參照ISO15189和 CL36文件的相關(guān)要求對(duì)CYP2C9&VKORC1基因檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)性能指標(biāo)驗(yàn)證，其目的在保證項(xiàng)目驗(yàn)收的基礎(chǔ)上，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，從而為臨床提供可靠的檢測(cè)結(jié)果，更好的為患者服務(wù)。