劉冬蘭，王艷華，廖瑜倩，萬以葉

(江西省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南昌 330029)

全世界每年約有一百余萬例新發(fā)胃癌患者，其致死率已排在腫瘤導(dǎo)致死亡原因的第二位[1]。我國胃癌是發(fā)病率及死亡率均排名第二位的惡性腫瘤，占全球胃癌的48%，發(fā)病最高的地區(qū)分布于我國西北及東部沿海區(qū)域[2]。胃癌術(shù)后有50%以上的患者將出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，這些患者5年生存率僅4-5%[3]，因此術(shù)后行輔助化療預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，這將具有重要意義。胃癌術(shù)后輔助化療藥物主要有兩大類，即鉑類及氟尿嘧啶類[4]。目前我們迫切需要發(fā)現(xiàn)一些分子標(biāo)志物，它將預(yù)測胃癌的術(shù)后局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，從而指導(dǎo)胃癌的個(gè)體化治療。微小核糖核酸（miRNA)是一類大約有20-22個(gè)核糖核酸組成的非編碼RNA，它具有高度保守性，且能調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，逐漸成為新的分子標(biāo)志物[5，6]。miRNA能降解mRNA或阻礙其翻譯，在其下游信號(hào)通路調(diào)控蛋白質(zhì)的表達(dá)[7]。微小核糖核酸單核苷酸多態(tài)性（miRNA SNP)位于miRNA前體或成熟結(jié)構(gòu)中，它能改變miRNA的數(shù)量和質(zhì)量[8，9]。有研究表明miRNA相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性與胃癌的發(fā)病有關(guān)[10]。目前miRNA-27a rs895819與胃癌發(fā)臨床病理特征及生存的研究相對(duì)較少。本研究在胃癌術(shù)后接受奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類患者中分miRNA-27ars895819與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2011年1月至2012年12月江西省腫瘤醫(yī)院手術(shù)的胃癌患者，共98例，均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；通過D2，R0手術(shù)切除（ⅠB-Ⅲ期）；術(shù)后均接受奧紗利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶類藥物輔助化療6個(gè)月，未接受術(shù)前新輔助化放療或輔助放療。

1.2 治療方法 輔助化療方案具體為：⑴84例患者使用mFOLFOX6方案，奧沙利鉑85mg/m2ivgttd1+亞葉酸鈣400mg/m2ivgttd1+氟尿嘧啶400mg/m2ivd1+氟尿嘧啶 2400mg/m2civ46h，Q2W×12次。⑵8例患者使用XELOX方案，奧沙利鉑130mg/m2ivgttd1+卡培他濱 1000mg/m2pod1-14，Q3W×8次。⑶6例患者使用SOX方案，奧沙利鉑130mg/m2ivgttd1+ 替 吉 奧 40-60mgpobidd1-14，Q3W×8次。

1.3 觀察指標(biāo) 全組患者每3個(gè)月進(jìn)行影像學(xué)評(píng)價(jià)了解患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況，記錄無病生存期及總生存期。

1.4 miRNA SNP檢測方法 全組患者在化療前采集外周血標(biāo)本5ml。采用Sequenom實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行SNP分型檢測。具體流程：首先整理SNP序列信息成標(biāo)準(zhǔn)格式；結(jié)合文獻(xiàn)并采用AssayDesigner3.1軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，確定目的位點(diǎn)：5'-ACGTTGGATGGGAACTTAGCCACTGTGAAC -3'（上游引物）和5'-ACGTTGGATGAGGGCTTAGCTG CTTGTGAG-3'（下游引物）；合成引物，引物稀釋，樣本檢測定量；PCR擴(kuò)增反應(yīng)；384孔SAP純化反應(yīng)；384孔單堿基延伸反應(yīng)，樹脂純化，上機(jī)檢測，收集數(shù)據(jù)。由北京博淼生物公司合成及檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存單因素分析，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)，采用COX分險(xiǎn)比例模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)。

表1 miRNA-27a rs895819與臨床病理特征的關(guān)系

2 結(jié)果

2.1 全組患者的基本特征 全組患者男性69例，女性 29例，69例患者年齡＜60歲，29例患者年齡≥60歲。90例患者病灶位于非賁門部（91.8%），8例位于賁門部（8.2%）。27例（27.6%）高分化腺癌，71例（72.4%）低分化及印戒細(xì)胞癌。浸潤深度T1-219例（19.4%），浸潤深度 T3-479例（80.6%）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例（70.4%）；37例（37.8%）Ⅰ-Ⅱ期，61例（62.2%）Ⅲ期。

2.2 miRNA-27a rs895819與臨床病理特征的關(guān)系miRNA-27a rs895819 基因型（AA，AG，GG)及顯性模型、隱性模型均與胃癌術(shù)后臨床特征無相關(guān)性。（見表 1）。

2.3 miRNA-27a rs895819及臨床病理特征與無病生存和總生存的關(guān)系 ＜60歲患者3年無病生存率為42.19%，≥60歲患者 3年無病生存率為 41.71%。全組患者3年總生存率為73.4%。浸潤深度與3年無病生存率明顯相關(guān)。T1-2患者的3年無病生存率明顯高于T3-4，分別為73.53%和32.43%（P=0.011）。臨床分期與3年總生存率顯著相關(guān)，Ⅰ-Ⅱ；Ⅲ期患者3年總生存率分別為91.51%和56.92%?；蚍中团c3年總生存期明顯相關(guān)，AA，AG，GG基因型3年總生存期分別為79.55%，74.6%，33.33%（P=0.012）；部位（P=0.56)，分化程度（P=0.160)和N分期（P=0.063)與3年總生存期無明顯相關(guān)性。隱性模型中，AA+AG基因型患者的3年總生存率顯著高于GG型，分別為77.22%和33.33%。見表2。COX多因素分析顯示，淋巴結(jié)狀態(tài)（P=0.014，RR=6.027，95%CI 1.478-32.590) 和rs895819 基因型 （P=0.004，RR=8.281，95%CI 0.025-0.496）為總生存的獨(dú)立影響因素。見表3。

3 討論

miR-27a rs895819位于19號(hào)染色體短臂上，處于pre-miRNA-27a莖環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)夾中，會(huì)被核糖核酸內(nèi)切酶（Dicer酶）切割，而影響miRNA-27a前體的成熟[11]。rs895819堿基A＞G突變可縮短莖環(huán)結(jié)構(gòu)，阻礙 miRNA-27a 的成熟[12，13]。 miRNA-27a rs895819與惡性腫瘤的發(fā)生，發(fā)展可能有關(guān)。中國學(xué)者劉芳騰[14]Meta分析顯示pre-miR-27a基因rs895819多態(tài)性與大腸癌易感性之間具有相關(guān)性，并且GG突變型具有增加罹患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。劉春桃等[15]研究顯示miR-27a rs895819基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生可能無關(guān)。而Sun[16]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)在rs895819雜合型/突變型（AG/GG）均增加，分層分析發(fā)現(xiàn)老年不吸煙的農(nóng)村男性（＞58歲）發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，究其原因是rs895819影響了miRNA-27a的表達(dá)量；另外發(fā)現(xiàn)rs895819雜合型/突變型（AG/GG）與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，與胃癌的發(fā)病部位，浸潤深度或腫瘤分級(jí)不相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miRNA-27a rs895819基因型與胃癌臨床特征不相關(guān)，這可能與病例數(shù)有關(guān)，需要擴(kuò)大入組患者，在以后的研究中進(jìn)一步證實(shí)。

表2 臨床病理特征、遺傳變異與生存的關(guān)系

表3 COX預(yù)后多因素分析

Wu等[17]研究顯示，收集的273例胃癌組織中，miR-27a的表達(dá)量均高于相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織，miR-27a的表達(dá)量增加，促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，遷移，轉(zhuǎn)移，它是通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用于其靶基因SFRP1而實(shí)現(xiàn)其致癌功能的。Ding[18]學(xué)者同樣發(fā)現(xiàn)，miR-27a表達(dá)量在胃癌組織中增高，miR-27a表達(dá)增高與胃癌臟器轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，局部浸潤深度和TNM分期有關(guān)，miR-27a通過作用于PHLPP2，激活下游AKT/GSK3β信號(hào)通路，最后導(dǎo)致胃癌的增殖及轉(zhuǎn)移。我們的后續(xù)研究將增加病理組織miR-27a表達(dá)量的檢測，以明確miR-27a表達(dá)量對(duì)預(yù)后的影響。

Xu[19]臨床試驗(yàn)得出miR-27a rs895819基因多態(tài)性與臨床特征及胃癌的生存均不相關(guān)，但在亞組分析中，TNMⅠ-Ⅱ期患者，rs895819雜合型（AG）較野生型（AA）生存具有優(yōu)勢，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臟器轉(zhuǎn)移中，攜帶rs895819雜合型和突變型（AG+GG）比純野生型（AA）生存期更長。而我們的研究結(jié)果與之不一致，我們得出rs895819純突變型GG較雜合子AG、野生型AA預(yù)后均差，其可能與純突變型過表達(dá)mir-27a，促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和增殖有關(guān)，這與既往其他文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。Li J研究[20]結(jié)果顯示miR-27a的表達(dá)上調(diào)，使人肺腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，miR-27a通過抑制RKIP靶基因，而RKIP可能通過NF-kB/Snail而引起順鉑的耐藥[21]。另有學(xué)者[22]對(duì)膀胱癌細(xì)胞研究顯示，miR-27a抑制靶基因SLC7A11，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥，如果下調(diào)miR-27a的表達(dá)或用SLC7A11的抑制劑柳氮磺胺吡啶，將能逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的耐藥。另有研究[23]發(fā)現(xiàn)miR-27a的表達(dá)可能影響白種人5-氟尿嘧啶藥物的代謝，如果既存在miRNA-27a rs895819，又有DPD風(fēng)險(xiǎn)變異，＞70%白種人患者早期將出現(xiàn)嚴(yán)重的氟尿嘧啶的毒副反應(yīng)；而無DPD變異下，miRNA-27a rs895819可能調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白家族中的兩位成員，即Bcl-2和Bax。miR-27a rs895819是否會(huì)影響胃癌奧沙利鉑的敏感性及我國5-氟尿嘧啶藥物的代謝目前還不清楚，需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miRNA-27a rs895819A/G基因多態(tài)性與胃癌術(shù)后病理特征無關(guān)，可能與胃癌術(shù)后預(yù)后相關(guān)，野生型+雜合型（AA+AG）患者與純突變型（GG）患者相比，生存期均延長，預(yù)后更好。但本研究入組患者有限，可能與真實(shí)的結(jié)果有一定的偏差，今后還需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證，并進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。