馮 蔚 李鎮(zhèn)剛 冉瑞法 肖圣燕

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101)

桑樹(MorusalbaL.)屬多年生木本植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種，其葉片為家蠶的飼料[1]。桑樹組織培養(yǎng)是分離樹體的器官或組織的一部分(外植體)接種到培養(yǎng)基上，在無菌和人工控制的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長發(fā)育，并再生成完整植株的過程[2]。雖然桑樹的組織培養(yǎng)研究起步較晚，但桑樹的組織培養(yǎng)也取得了一定的進(jìn)展[3-5]，其中桑樹冬芽是比較好的桑樹組織培養(yǎng)外植體[6]。目前，主要通過控制細(xì)胞分裂素6-BA(6-芐氨基嘌呤)和生長素NAA(α-萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)的濃度和類別來研究桑樹的組織培養(yǎng)[7-8]，許多學(xué)者做了大量關(guān)于植物組織培養(yǎng)中外植體消毒劑種類的研究，常用的外植體消毒劑有升汞、次氯酸鈉、漂白粉、過氧化氫、新潔爾滅等，其中升汞被普遍用于桑樹組織培養(yǎng)的消毒，雖然升汞的滅菌效果極佳，但易在植物材料上殘留，消毒后需用無菌水反復(fù)多次沖洗，而且對(duì)環(huán)境危害大，對(duì)人畜的毒性極強(qiáng)[9-10]。本試驗(yàn)旨在研究NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)初期冬芽生長情況的影響，以期能夠篩選出適合桑樹冬芽組織培養(yǎng)的生長調(diào)節(jié)劑最優(yōu)組合，提高桑樹冬芽組織培養(yǎng)的成功效率，同時(shí)研究一種毒副作用小又廉價(jià)的消毒方法來避免或者減輕外植體的污染，以降低桑樹冬芽組織培養(yǎng)的成本并保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試桑樹冬芽 試驗(yàn)用桑樹冬芽采自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所種質(zhì)資源圃，桑樹品種為農(nóng)桑14號(hào)。2017年1月3日從種質(zhì)資源圃剪取帶有5～6個(gè)冬芽的莖段，帶回實(shí)驗(yàn)室，在無菌條件下剝?nèi)ネ鈱友亏[，至第1幼葉露出時(shí)，切取冬芽作為外植體備用。

1.1.2 主要試劑 基本培養(yǎng)基WPM(wood plant medium)，木本植物用培養(yǎng)基，青島日水生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；NAA，化學(xué)純，上海埃博商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；6-BA，生化試劑，上海新興化工試劑研究所產(chǎn)品；次氯酸鈣，粉劑，有效氯含量為28%，廣西田東錦星化工有限公司產(chǎn)品；3%過氧化氫溶液，昆明泰立康工貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度次氯酸鈣溶液的配制 將次氯酸鈣粉劑用蒸餾水分別配制成3%次氯酸鈣溶液(有效氯含量為0.84%)、10%次氯酸鈣溶液(有效氯含量為2.80%)、20%次氯酸鈣溶液(有效氯含量為5.60%)備用。

1.2.2 不同消毒藥劑對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)的影響試驗(yàn) 試驗(yàn)材料分別用3%次氯酸鈣溶液、10%次氯酸鈣溶液、20%次氯酸鈣溶液和3%過氧化氫溶液處理，每種消毒藥劑處理時(shí)間分別為1、3、5、10 min，消毒處理后用無菌水對(duì)桑樹冬芽進(jìn)行沖洗，沖洗5遍，然后將沖洗完的冬芽接種在WPM培養(yǎng)基中，平均7 d更換1次培養(yǎng)基，在第1次更換培養(yǎng)基時(shí)，調(diào)查不同消毒藥劑對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)的影響。

1.2.3 NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)的影響試驗(yàn) 在WPM培養(yǎng)基中，添加外源激素NAA和6-BA。NAA設(shè)2個(gè)濃度梯度，分別為0.01、0.02 mg/L，6-BA設(shè)3個(gè)濃度梯度，分別為0.30、0.60、0.90 mg/L，并設(shè)WPM培養(yǎng)基中不添加任何外源激素為空白對(duì)照，分析2種激素不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)的影響。每個(gè)處理接種3個(gè)桑樹冬芽，重復(fù)10次，各處理和重復(fù)隨機(jī)排列。桑樹冬芽組織培養(yǎng)環(huán)境為溫度25～28 ℃，相對(duì)濕度50%左右，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx，保持一定的通氣性，平均7 d更換1次培養(yǎng)基，在第1次更換培養(yǎng)基時(shí)，測量桑樹冬芽的直徑和長度生長量，培養(yǎng)30 d后，調(diào)查冬芽的長勢。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與測量方法

統(tǒng)計(jì)計(jì)算不同消毒藥劑、不同處理時(shí)間下桑樹冬芽的污染率和死亡率。桑樹冬芽直徑和長度生長量的測定參照文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。用游標(biāo)卡尺測量其直徑和長度，計(jì)算桑樹冬芽增大倍數(shù)。計(jì)算公式如下：污染率(%)=(桑樹冬芽污染數(shù)量/桑樹冬芽接種數(shù)量)×100；死亡率(%)=(桑樹冬芽死亡數(shù)量/桑樹冬芽接種數(shù)量)×100；桑樹冬芽直徑增大倍數(shù)=(最終桑樹冬芽直徑-接種桑樹冬芽直徑)/接種桑樹冬芽直徑；桑樹冬芽長度增大倍數(shù)=(最終桑樹冬芽長度-接種桑樹冬芽長度)/接種桑樹冬芽長度。NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽生長的影響數(shù)據(jù)用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒藥劑對(duì)桑樹冬芽消毒效果的影響

從表1和圖1可以看出，與3種不同濃度的次氯酸鈣溶液相比3%過氧化氫溶液的消毒效果較差，污染率較高，不適合做桑樹冬芽組織培養(yǎng)的消毒藥劑。不同濃度次氯酸鈣溶液做消毒藥劑時(shí)不僅污染率均低于3%過氧化氫溶液，且隨著次氯酸鈣溶液處理時(shí)間的延長，次氯酸鈣溶液濃度的增大，污染率呈下降的趨勢。特別是10%次氯酸鈣溶液和20%次氯酸鈣溶液在消毒時(shí)間延長到5 min后，污染率就降到了0。

表1不同消毒藥劑對(duì)桑樹冬芽消毒效果的影響

消毒藥劑處理時(shí)間/min污染率/%3%次氯酸鈣溶液140340520101010%次氯酸鈣溶液1303205010020%次氯酸鈣溶液120310501003%過氧化氫溶液11003805601050

圖1 不同消毒藥劑對(duì)桑樹冬芽消毒效果的影響

2.2 NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽生長的影響

從表2和圖2可以看出，將剝好的桑樹冬芽，接種于含有不同濃度的NAA和6-BA的WPM培養(yǎng)基中，待其生長1個(gè)月后，與對(duì)照相比，WPM培養(yǎng)基中加入生長調(diào)節(jié)劑后的桑樹冬芽生長均不同程度地得到了促進(jìn)，其中NAA和6-BA分別為0.01 mg/L和0.60 mg/L的生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)桑樹冬芽生長的影響最為顯著，桑樹冬芽膨大明顯，基本可略見葉形，有大葉長出。WPM培養(yǎng)基中加入其他配比的生長調(diào)節(jié)劑，濃度較低無法對(duì)桑樹冬芽的生長起到明顯的促進(jìn)作用，濃度過高又會(huì)對(duì)桑樹冬芽的生長產(chǎn)生抑制作用。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，在WPM培養(yǎng)基中加入0.01 mg/L的NAA和0.60 mg/L的6-BA是最適宜的桑樹冬芽組織培養(yǎng)的生長調(diào)節(jié)劑濃度組合。

表2NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽生長的影響

培養(yǎng)基直徑增長幅度/cm長度增長幅度/cm冬芽長勢WPM+0.01 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA3.162±0.418 ab4.092±0.699 ab略有膨大,少見顯露葉組織WPM+0.01 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA4.274±0.595 a5.478±0.892 a膨大明顯,基本可略見葉形,有大葉長出WPM+0.01 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA3.192±0.350 ab3.200±0.879 abc均略有膨大,稍顯露葉組織WPM+0.02 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA3.508±0.286 ab4.068±0.646 ab均有膨大,部分顯露葉組織,部分有1片小葉展出WPM+0.02 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA3.338±0.869 ab2.856±0.951 bc均有膨大,稍顯露葉組織,極少見有1片小葉略展出WPM+0.02 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA3.856±0.220 ab3.370±0.369 abc均有膨大,基本顯露葉組織,均有1片小葉長出WPM(CK)2.626±0.675 b1.194±0.320 c膨大不明顯,極少見顯露葉組織

表中同列數(shù)值后標(biāo)記的不同字母表示差異達(dá)0.05 顯著水平(鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn))。

A.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA，B.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA，C.WPM+0.01 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA，D.WPM+0.02 mg/L的NAA+0.30 mg/L的6-BA，E.WPM+0.02 mg/L的NAA+0.60 mg/L的6-BA，F(xiàn).WPM+0.02 mg/L的NAA+0.90 mg/L的6-BA，G.WPM(CK)。圖2 基本培養(yǎng)基WPM中添加不同濃度組合NAA和6-BA的桑樹冬芽生長情況

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)研究了4種消毒藥劑不同的處理時(shí)間對(duì)桑樹冬芽外植體的消毒效果，10%次氯酸鈣溶液和20%次氯酸鈣溶液消毒5 min時(shí)污染率已經(jīng)降到最低為0，但考慮到消毒簡便、成本低廉及消毒藥劑對(duì)外植體的損傷程度低等因素[12]，10%次氯酸鈣溶液消毒5 min是最適宜的消毒方法。另外，生長素類和細(xì)胞分裂素類的比例是控制組織培養(yǎng)中芽和根分化的決定性因素之一[13]。一般來說高濃度的細(xì)胞分裂素與低濃度的生長素配合可直接誘導(dǎo)外植體再生不定芽或誘導(dǎo)生成胚狀體[10]。植物激素在桑樹組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生過程中也起著重要作用，細(xì)胞分裂素是桑芽培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。研究表明，6-BA更適合桑樹無菌芽的繼代增殖[14-16]，目前，主要通過控制細(xì)胞分裂素6-BA和生長素NAA、IBA、2，4-D的濃度和類別來研究桑樹的組織培養(yǎng)[17-18]，本試驗(yàn)研究比較了WPM培養(yǎng)基中加入NAA和6-BA不同濃度組合對(duì)桑樹冬芽外植體組織培養(yǎng)的影響，其中WPM培養(yǎng)基中添加0.01 mg/L的NAA和0.60 mg/L的6-BA，桑樹冬芽的生長情況最好，冬芽直徑的增長幅度和長度的增長幅度與對(duì)照相比都達(dá)到了顯著水平，桑樹冬芽膨大明顯，基本可略見葉形，有大葉長出。

本試驗(yàn)研究了生長調(diào)節(jié)劑對(duì)桑樹冬芽組織培養(yǎng)初期冬芽直徑和長度生長情況的影響，國內(nèi)雖有針對(duì)外植體組織培養(yǎng)中生長情況測量的報(bào)道[11]，但在桑樹組織培養(yǎng)中還未得到應(yīng)用。生長情況測量雖然在一定程度上增加了污染的概率，但在桑樹冬芽組織培養(yǎng)的調(diào)控上有了量化的指標(biāo)，并在組織培養(yǎng)初期就可篩選出較好的培養(yǎng)條件，提高了桑樹冬芽組織培養(yǎng)的效率。

本試驗(yàn)沒有對(duì)pH值、糖類以及其他因素進(jìn)行試驗(yàn)研究，這有待于進(jìn)一步試驗(yàn)研究。