蔡小彥，王玉紅，許艷超，周忠麗，王星星，侯玉清，王坤波，劉方

（棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽(yáng)455000）

棉花是世界上最重要的天然纖維來源，也是重要的油料作物之一。我國(guó)是主要的產(chǎn)棉大國(guó)和紡織品出口國(guó)，棉花在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位[1]。種間遠(yuǎn)緣雜交是實(shí)現(xiàn)優(yōu)良農(nóng)藝性狀從1個(gè)物種向另1個(gè)物種轉(zhuǎn)移的有效途徑，也是作物遺傳改良的重要途徑。在棉花栽培品種的遺傳改良研究中，通過棉花遠(yuǎn)緣雜交把野生種質(zhì)資源特有的優(yōu)良性狀進(jìn)行遺傳重組，創(chuàng)制了大量的種間雜種材料并培育出許多高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強(qiáng)的棉花品種[2-7]。獲得繼承雙親基因的真雜種后代是有目的地開展棉花遺傳改良及其他研究的前提和基礎(chǔ)。棉花是常異花授粉植物，人工去雄不徹底常造成后代真、假雜種混雜，因此對(duì)雜交后代的真實(shí)性鑒定十分必要。

雜種鑒定的傳統(tǒng)方法主要有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、同工酶學(xué)以及分子標(biāo)記等方法。形態(tài)學(xué)鑒定的周期較長(zhǎng)，工作量大，對(duì)于形態(tài)差異小的材料鑒定困難，可靠性低。細(xì)胞學(xué)鑒定程序繁瑣，技術(shù)水平要求較高且分辨率不高，對(duì)于染色體短或結(jié)構(gòu)差異較小的個(gè)體難以準(zhǔn)確鑒定。同工酶則由于酶種類限制不能反映全部的結(jié)構(gòu)基因的信息，酶切位點(diǎn)少，多態(tài)性水平較低。分子標(biāo)記的發(fā)展，提供了從DNA水平上來檢測(cè)后代純度的有利工具。其中SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記具有在基因組分布廣泛，多態(tài)性高，不受外界環(huán)境、組織類別、發(fā)育時(shí)期等條件的影響等諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于油菜、花生、大豆、小豆、茄子、葡萄、甘蔗等植物的真、假雜種以及種子純度檢測(cè)工作[8-13]。SSR分子標(biāo)記已廣泛用于棉種純度和雜交種純度鑒定[14-17]及常規(guī)栽培品種的指紋圖譜[18-19]。本研究利用棉花SSR標(biāo)記鑒定不同棉種間多個(gè)遠(yuǎn)緣雜交組合的F1雜種，并通過田間表型鑒定進(jìn)行驗(yàn)證，以期提高遺傳作圖群體的構(gòu)建效率，減少田間工作量。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試親本材料宿生保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所南繁中心的國(guó)家野生棉種質(zhì)圃 （海南三亞崖城），2014年10月至2015年6月通過人工去雄雜交配制多個(gè)種間雜交組合（表1）。2016年1月將獲得的F1種子催芽、營(yíng)養(yǎng)缽育苗，待第1片真葉平展時(shí)移栽到田間，幼苗長(zhǎng)至4葉1心時(shí)取嫩葉保存于－80℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1基因組DNA提取。采用改良的CTAB法[20]提取基因組DNA，采用0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，將DNA稀釋成30 ng·μL－1左右的工作液備用。

表1 棉花種間不同雜交組合后代真假雜種的鑒定結(jié)果

1.2.2SSR標(biāo)記篩選。SSR分子標(biāo)記來自基于雷蒙德氏棉序列草圖構(gòu)建的棉花全基因組DNA標(biāo)記圖譜[21]，SSR分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的引物序列信息源于數(shù)據(jù)庫(kù) Cotton Marker Database（http://www.cottonmarker.org/），引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用備選的SSR引物對(duì)父、母本進(jìn)行多態(tài)性分析，選擇條帶清晰穩(wěn)定、多態(tài)性好的標(biāo)記用于F1雜種鑒定。

1.2.3PCR擴(kuò)增。 PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反應(yīng)體系10 μL，包括5.0 μL的2×Taq Master Mix for PAGE，1.0 μL 30 ng·μL－1的 DNA 模板，0.2 μL 正、反向 SSR 引物（10 μmol·L），3.6 μL ddH2O。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火45 s,72℃延伸50 s,30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用0.8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色并拍照存檔。

1.2.4田間形態(tài)鑒定及育性調(diào)查。按照取樣編號(hào)，待雜種后代長(zhǎng)至開花期進(jìn)行雜種后代的田間性狀及育性調(diào)查。

2 結(jié)果和分析

2.1 親本間SSR標(biāo)記多態(tài)性篩選

利用80對(duì)SSR引物對(duì)30個(gè)種間雜交組合的親本進(jìn)行多態(tài)性分析，共篩選出11對(duì)多態(tài)性引物（表 2），用于 F1雜種鑒定。

表2 11對(duì)多態(tài)性SSR引物的序列

2.2 F1 雜種的分子鑒定

用篩選出來的多態(tài)性引物檢測(cè)每個(gè)雜交組合的F1植株，每個(gè)雜交組合用至少2對(duì)SSR引物相互驗(yàn)證。在30個(gè)雜交組合中，有22個(gè)雜種組合獲得真雜種后代，8個(gè)雜交組合沒有獲得真雜種。獲得真雜種的雜交組合，其后代數(shù)量也不盡相同，其中中草1號(hào)×擬似棉、中0316×雷蒙德氏棉等10個(gè)雜交組合的雜交成功率達(dá)到了100%。30個(gè)雜交組合的雜交F1的鑒定結(jié)果見表2。F1真雜種同時(shí)具有父本和母本雙方的條帶，呈共顯性(圖1)，而假雜種只有來自母本的擴(kuò)增條帶。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定及育性調(diào)查

對(duì)于種間形態(tài)差異較大的雜交組合，其雜種后代在苗期及蕾期的形態(tài)介于雙親之間，很容易通過形態(tài)觀察確定真、假雜種。例如中0316與雷蒙德氏棉的雜種在第1～4片真葉期為心形葉片；至5葉期后，葉片出現(xiàn)1/3淺葉裂，被短密絨毛；到花蕾期性狀更加明顯，雜種后代的花具有紫紅色花基斑。但F1是三倍體，后代不育。中草1號(hào)與雷蒙德氏棉雜種后代的葉片具有草棉的5深葉裂特征，但較母本葉片多毛且厚；花冠顏色和大小介于兩個(gè)親本之間；紫色大基斑；具有嫩黃色花粉，但是花粉敗育，雜種后代不育。后代雜種的形態(tài)學(xué)鑒定與SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果完全一致。

圖1 瑟伯氏棉×三裂棉F1 真假雜種鑒定電泳圖

對(duì)于種間形態(tài)差異較小的雜種后代，通過形態(tài)學(xué)鑒定具有較大困難。例如，野生種瑟伯氏棉和三裂棉的形態(tài)相似，只有細(xì)微的差別。其雜種F1很難通過簡(jiǎn)單的形態(tài)觀察區(qū)分真假雜種；另外，父母本親緣關(guān)系較近，雜種后代育性良好。因此，對(duì)于父母本形態(tài)學(xué)差異較小的雜交組合的后代需要借助分子標(biāo)記等手段來鑒定。

3 討論

雜交育種是培育棉花新品種的重要途徑。由于棉花是常異花授粉植物，在自然狀態(tài)下，自花授粉率達(dá)到95%左右[22]。人工去雄不徹底會(huì)導(dǎo)致雜交后代中可能存在一定比例的自交后代，或由于雜交過程中外來花粉污染造成后代混雜，有必要對(duì)雜種后代進(jìn)行早期鑒定，提前剔除假雜種后代，提高育種效率，節(jié)約成本。

通過大量的種間雜交組合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)棉屬不同種間雜交組合獲得真雜種的成功率不同。我們選擇3個(gè)栽培棉種（中草1號(hào)，中亞1號(hào)以及陸地棉中0316）分別與多個(gè)野生種進(jìn)行雜交試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞洲棉（中亞1號(hào)）與雷蒙德氏棉、擬似棉、斯特提棉、比克氏棉和圓葉棉等野生種雜交困難，沒有獲得雜交后代，雜交成功率為0。然而，陸地棉（中0316）和草棉（中草1號(hào)）與雷蒙德氏棉、擬似棉、圓葉棉等野生種較容易獲得真雜種后代，雜交成功率均達(dá)到100%。草棉和亞洲棉均是二倍體A基因組的栽培種，二者與雷蒙德氏棉的雜交成功率為何有如此大的差異，還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多個(gè)雜交組合F1進(jìn)行SSR分子標(biāo)記鑒定與全生育期形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致，二者互為印證。SSR分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)勢(shì)是可以在幼苗期提前鑒定真假雜種，而形態(tài)觀察在幼苗期往往很難看出差別，一般需要到開花后才能確定真假雜種。另外，對(duì)于親本表型差異較小的雜種后代，形態(tài)學(xué)鑒定法不太適用。SSR分子標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分雜合位點(diǎn)和純合位點(diǎn)，并且重復(fù)性及穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)簡(jiǎn)單，理論上采用1對(duì)SSR引物即可完成對(duì)雜種后代的準(zhǔn)確鑒定[11-13]。棉花的大量SSR引物序列已經(jīng)發(fā)表，方便進(jìn)行引物的選擇。另外雷蒙德氏棉、亞洲棉等棉花全基因組測(cè)序完成后，根據(jù)棉花全基因組序列開發(fā)了大批量的SSR標(biāo)記，大大豐富了棉花SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，SSR標(biāo)記可以作為檢測(cè)棉花真假雜種的理想標(biāo)記。