趙國棟，趙同生，李春敏，付 友，張新生

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

我國蘋果屬種質(zhì)資源豐富，東北華北地區(qū)亦有大量分布，僅河北地區(qū)調(diào)查確認(rèn)的蘋果野生種多達(dá)24種[1]，種內(nèi)遺傳多樣性極為豐富，其中蘊(yùn)藏著大量的抗逆性優(yōu)異種質(zhì)，具有潛在的利用價(jià)值，絕大多數(shù)種類是很好的砧木資源[2]。在我國北方地區(qū)，尤其是在高緯度蘋果栽培區(qū)，冬季嚴(yán)寒，絕對低溫低，持續(xù)時(shí)間長，低溫凍害常給蘋果生產(chǎn)造成極大損失，砧木的抗寒力在決定蘋果植株能否安全越冬方面起著決定性作用，因此抗寒性砧木選育是我國北方地區(qū)蘋果生產(chǎn)的關(guān)鍵性工作。

關(guān)于植物的抗寒性的研究有不少報(bào)道，常用的抗寒性評價(jià)方法包括田間調(diào)查法、恢復(fù)生長法、解剖結(jié)構(gòu)觀察法、枝條電導(dǎo)法、生理生化測定法等，其中電導(dǎo)法常與恢復(fù)生長法結(jié)合應(yīng)用[3-4]，可以同時(shí)處理大量材料，簡便易行，準(zhǔn)確度高[5]，目前應(yīng)用最為廣泛，生理生化測定法中的丙二醛、脯氨酸等指標(biāo)是評價(jià)抗寒性的敏感指標(biāo)[6-7]，在梨[8]、蘋果[3,9]、櫻桃[10]、葡萄[11]、核桃[4-5,12]等的抗寒性評價(jià)中已有大量報(bào)道。然而植物的生理過程是錯(cuò)綜復(fù)雜的，植物的抗性受多種因素影響，孤立地用某一指標(biāo)很難反映植物的抗寒的實(shí)質(zhì)，也不利于揭示植物抗寒的本質(zhì)。隸屬函數(shù)評估法是采用模糊數(shù)學(xué)原理，通過計(jì)算構(gòu)成各指標(biāo)相應(yīng)的隸屬函數(shù)值，進(jìn)行加權(quán)得到其綜合評價(jià)值[13]，可較為全面地對考察指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，目前在梨[8]、葡萄[11]、核桃[4]等果樹品種和砧木上的抗寒性鑒定上已有大量應(yīng)用，結(jié)果可靠且具有可比性。

本研究中的11個(gè)野生砧木是從燕山山區(qū)收集，保存的，對燕山地區(qū)的土壤、氣候環(huán)境有一定的適應(yīng)性，前人對其抗病性、耐缺鐵和耐鹽堿性等方面已有研究[14-16]，其中耐缺鐵性資源5份、耐鹽性資源5份，耐堿性資源5份，抗斑點(diǎn)落葉病資源4份，但關(guān)于其抗寒性尚未見報(bào)道，因此有必要繼續(xù)進(jìn)行抗寒性評價(jià)。本研究對11個(gè)野生砧木在7個(gè)低溫條件下的枝條電導(dǎo)率、萌芽率、丙二醛含量、脯氨酸含量進(jìn)行了比較，同時(shí)結(jié)合隸屬函數(shù)法對其耐寒性進(jìn)行了綜合評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2016年1-3月進(jìn)行，供試材料采自定植于河北省農(nóng)林科學(xué)院昌黎果樹研究所野生砧木資源圃(39°43′N，119°10′E)中的11個(gè)10年生蘋果野生砧木(表1)，從樹體中部隨機(jī)采集無病蟲害的1年生枝條，每品種105根，共采1 155根，帶回實(shí)驗(yàn)室用自來水沖洗干凈，去離子水沖洗3次，濾紙吸干表面水分，石蠟封剪口，為了保持材料與采樣時(shí)田間溫度相近，-10℃下保存。

1.2 低溫處理

將所采枝條隨機(jī)分為7組，每組11個(gè)品種，每個(gè)品種15根，用干凈紗布包裹好，密封于塑料袋中，分別置于GDJS-500L型高低溫交變箱(江蘇)進(jìn)行低溫處理，共設(shè)置-10、-20、-25、-30、-35、-40℃和-45℃等7個(gè)低溫梯度，設(shè)置4℃·h-1的降溫速率，到達(dá)設(shè)定溫度后保持12 h，之后以同樣速率升溫至0℃，保持2 h，然后室溫解凍12 h，用于指標(biāo)測定。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 相對電導(dǎo)率 取低溫冷凍處理后的枝條3根，分別剪成3～5 mm的小段，混勻，稱取2 g放入帶刻度試管，并加入30 mL蒸餾水，室溫下浸泡24 h后，用DDS-11a型電導(dǎo)率儀(上海)測定初始電導(dǎo)率，然后將試管用保鮮膜封口，沸水浴30 min，冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)充至原溶液刻度處，搖勻，靜置10 min測定終電導(dǎo)率，重復(fù)3次。相對電導(dǎo)率計(jì)算公式為：

相對電導(dǎo)率=初始電導(dǎo)率/終電導(dǎo)率×100%

1.3.2 恢復(fù)生長法調(diào)查萌芽率 將低溫處理后的枝條室溫解凍后，在0℃下保存1個(gè)月，在PR系列微電腦人工氣候箱(江蘇)里水培培養(yǎng)[3-4](20℃，3 000 lx)，待恢復(fù)生長30 d后，取出統(tǒng)計(jì)發(fā)芽情況。萌芽率=萌芽數(shù)/(15個(gè)芽)×100%，重復(fù)3次，每次3根枝條。

1.3.3 其他生理指標(biāo)測定 取低溫冷凍處理后的枝條3根，用去離子水沖洗干凈，避開芽眼，剪成3～5 mm的薄片，充分混勻，稱取0.5 g，充分研磨，測定脯氨酸、丙二醛含量。脯氨酸含量的測定采用茚三酮法[17]，丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法[17]，利用TU-1901紫外分光光度計(jì)(鄭州) 測定吸光光度值。每個(gè)品種重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，運(yùn)用Duncan檢驗(yàn)法對顯著性差異進(jìn)行多重比較(α=0.05)，各表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

半致死溫度LT50的計(jì)算方法[8,18-19]為：將溫度(t)和相對電導(dǎo)率(y)間的關(guān)系用Logistic方程進(jìn)行擬合，回歸模型為y=k/(1+ae-bt),(a、b>0，k=1)。將方程線性化處理后，得ln[(k-y)/y]=lna-bt，轉(zhuǎn)化為相對電導(dǎo)率(y)與溫度(t)的直線方程。通過直線回歸的方法求得a，b值及相關(guān)系數(shù)R，半致死溫度LT50=-lna/b。

利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評價(jià)[8]，脯氨酸為正效應(yīng)，隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為：Uij=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，相對電導(dǎo)率、丙二醛為負(fù)效應(yīng)，隸屬函數(shù)值計(jì)算公式為：Uij=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)，其中Xij代表指標(biāo)測定值，Xmin、Xmax分別代表指標(biāo)最小值和最大值。Uij為第i個(gè)品種第j個(gè)溫度階段相關(guān)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值。

表1 供試野生砧木品種

2 結(jié)果與分析

2.1 恢復(fù)生長后蘋果野生砧木枝條萌芽率的比較

低溫處理后的枝條在水培條件下恢復(fù)生長30 d后調(diào)查萌芽情況，11個(gè)野生砧木品種的枝條萌芽率隨處理溫度降低呈下降趨勢，但不同砧木的萌芽率變化范圍差異較大，以圍矮1號，圍矮4號，克勒溝林場大果山定子為例，3個(gè)品種的萌芽率變化范圍分別在14.5%～50.4%，0.0%～53.8%，35.0%～92.9%，可能與品種自身萌芽力不同有關(guān)，故以-10℃溫度下的枝條萌芽率為對照(萌芽率為100.0%)，比較各砧木不同溫度下的相對萌芽率，由表2可知，圍矮4號、Sdw1恢復(fù)生長后的枝條萌芽率分別在-20、-25℃開始迅速下降，分別在-35、-40℃時(shí)萌芽率為0，其他砧木枝條萌芽率下降相對平緩，-35℃下，除八棱海棠外，萌芽率降低幅度均<50.0%，-40℃下，各野生砧木的萌芽率大小順序?yàn)閲?號>Spy227>克勒溝林場大果山定子>特大果山定子>五峰山海棠4號>圍矮1號>八棱海棠>串鈴海棠>圍矮3號>Sdw1/圍矮4號。

2.2 不同低溫處理后蘋果野生砧木枝條相對電導(dǎo)率的比較

各野生砧木的相對電導(dǎo)率隨著溫度降低呈“S”形上升趨勢(表3)，在-10～-20℃降溫階段，相對電導(dǎo)率呈下降趨勢，可能與降溫初期枝條的反應(yīng)敏感有關(guān)，屬自我保護(hù)功能[20]。之后，八棱海棠、Sdw1、圍矮3號、克勒溝林場大果山定子、Spy227在-30～-35℃，圍矮1號、圍矮2號和特大果山定子在-30～-40℃，五峰山海棠4號在-35～-40℃，串鈴海棠在-25～-40℃，圍矮4號在-20～-25℃、-30～-35℃分別出現(xiàn)相對電導(dǎo)率迅速升高，總的來看，在不同低溫下，圍矮4號、Sdw1的相對電導(dǎo)率較大，特大果山定子、圍矮2號相對電導(dǎo)率較小，其他砧木互有大小。各砧木Logistic方程擬合的相關(guān)系數(shù)0.795～0.916，均大于臨界相關(guān)系數(shù)(r=0.754，α=0.05)，擬合度較好，各砧木半致死溫度(LT50)介于-22.32～-38.58℃，特大果山定子LT50最低-38.58℃，圍矮4號最高(-22.32℃)，根據(jù)LT50，得出各野生砧木抗寒性強(qiáng)弱順序?yàn)樘卮蠊蕉ㄗ?圍矮2號>Spy227>克勒溝林場大果山定子>八棱海棠>圍矮1號>圍矮3號>五峰山海棠4號>串鈴海棠> Sdw1>圍矮4號，與恢復(fù)生長的萌芽率調(diào)查結(jié)果基本一致。

2.3 不同低溫處理后蘋果野生砧木枝條脯氨酸含量的變化

由表4知，-10℃下，特大果山定子脯氨酸含量最大，其次是圍矮2號，再次是Spy227，與其他砧木差異顯著，-20℃下，圍矮4號、Sdw1、串鈴海棠的脯氨酸含量迅速增加，增幅分別為134.5%、115.7%、94.8%，其他砧木增幅在0～78.9%，特大果山定子增幅最小。之后隨著處理溫度下降，各砧木脯氨酸含量變化趨勢無明顯規(guī)律性，圍矮4號、串鈴海棠、Spy227在-20℃，Sdw1在-25℃，特大果山定子、八棱海棠在-30℃，圍矮1號、圍矮2號、圍矮3號在-35℃，五峰山海棠4號、克勒溝林場大果山定子在-45℃達(dá)到最大值，總體來看，7個(gè)溫度下圍矮2號和特大果山定子脯氨酸含量的平均值明顯高于其他砧木，其他砧木差異不顯著。

2.4 不同低溫處理后蘋果野生砧木枝條丙二醛含量的變化

由表5知，各砧木枝條的丙二醛含量都是-10℃高于-20℃，-10～-40℃范圍內(nèi)，各砧木呈雙峰變化趨勢，即“升高-降低-升高-降低”， 五峰山海棠4號丙二醛含量最大值在-45℃，其他砧木最大值集中在-25～-30℃，7個(gè)溫度下，各砧木丙二醛含量差異顯著，圍矮2號、特大果山定子的丙二醛含量始終最小，其次是Spy227，而Sdw1、串鈴海棠、圍矮4號、五峰山海棠4號丙二醛含量的平均值明顯高于其他砧木，從低溫處理后丙二醛含量的穩(wěn)定性來看，Spy227、特大果山定子、五峰山海棠4號、圍矮2號的丙二醛含量相對穩(wěn)定，Sdw1最不穩(wěn)定。

表2 恢復(fù)生長后11種野生砧木的枝條萌芽率

表3 不同低溫處理下11種野生砧木枝條相對電導(dǎo)率的變化

注：不同字母表示不同野生砧木間差異顯著(P<0.05)。表4、表5同。

表4 不同低溫處理下11個(gè)野生砧木品種枝條脯氨酸含量的變化

表5 不同低溫處理下11個(gè)野生砧木品種枝條丙二醛含量的變化

2.5 不同砧木抗寒性綜合評價(jià)

由于研究中品種、處理溫度較多，各指標(biāo)所反映的抗寒性信息復(fù)雜，因此不能單獨(dú)運(yùn)用某個(gè)指標(biāo)對蘋果野生砧木的抗寒性進(jìn)行評價(jià)。為了全面、直觀地反映蘋果野生砧木在各低溫處理下的抗寒性，運(yùn)用隸屬函數(shù)法對11個(gè)野生砧木品種的抗寒能力進(jìn)行綜合排序，平均隸屬函數(shù)值越大，表明抗寒能力越強(qiáng)，反之抗寒能力越弱。結(jié)果表明(表5)，各野生砧木的平均隸屬函數(shù)值為0.207 9～0.868 4，圍矮2號的平均隸屬函數(shù)值最大，Sdw1平均隸屬函數(shù)值最小。根據(jù)平均隸屬函數(shù)值大小，11個(gè)野生砧木品種的抗寒能力強(qiáng)弱排序?yàn)閲?號>特大果山定子>Spy227>八棱海棠>圍矮3號>克勒溝林場大果山定子>圍矮1號>五峰山4號>串鈴海棠>圍矮4號>Sdw1，與半致死溫度所得抗寒性排序相近。

表6 11個(gè)野生砧木品種生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

3 結(jié)論與討論

植物組織受凍后，細(xì)胞膜受到傷害，細(xì)胞膜透性會不同程度增加，導(dǎo)致電解質(zhì)外滲，抗寒性不同，外滲物多少也不一樣，通常情況下，抗寒性強(qiáng)的品種外滲物相對較少，抗寒性弱的品種外滲物一般會較多[21]，外滲物的多少可通過測定電導(dǎo)率來表示，因此相對電導(dǎo)率的大小是評價(jià)植物耐寒性的一個(gè)重要指標(biāo)，本研究中11個(gè)蘋果野生砧木品種的相對電導(dǎo)率隨處理溫度下降呈“S”形增加，規(guī)律較明顯，并且在不同的處理溫度下，結(jié)果均顯示抗寒性弱的砧木相對電導(dǎo)率較大，抗寒性強(qiáng)的砧木相對電導(dǎo)率較小，這與李小琴[12]在核桃、李桂榮[22]在葡萄上的研究結(jié)果一致，利用Logistic曲線方程擬合相對電導(dǎo)率和溫度的關(guān)系獲得了11種野生砧木的低溫半致死溫度LT50，根據(jù)LT50大小，得出抗寒性大小順序?yàn)樘卮蠊蕉ㄗ?圍矮2號>Spy227>克勒溝林場大果山定子>八棱海棠>圍矮1號>圍矮3號>五峰山4號>串鈴海棠> Sdw1>圍矮4號。LT50是植物凍害能否恢復(fù)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，是臨界死亡的最低溫度，昌黎地區(qū)1月份最冷平均最低氣溫-10℃，歷史極端最低氣溫達(dá)到-24℃以下，試驗(yàn)中11種砧木在田間均未出現(xiàn)過嚴(yán)重凍害。而在實(shí)驗(yàn)室條件下，圍矮4號、sdw1的LT50分別為-22.32、-23.29℃，抗寒力表現(xiàn)低于田間，可能與試驗(yàn)低溫持續(xù)時(shí)間長、溫度降低和恢復(fù)的速率較快有關(guān)，說明相對電導(dǎo)率和LT50相結(jié)合可以簡單快捷地比較蘋果野生砧木的抗寒性。但受試驗(yàn)取材和試驗(yàn)控制條件等方面制約，與品種實(shí)際可忍受的低溫極限值存在一定的差異。馬小河[23]在釀酒葡萄上和李遠(yuǎn)發(fā)[24]在麻風(fēng)樹上的研究也有類似情況。

植物在低溫脅迫下，活性氧超過正常水平時(shí)即可產(chǎn)生積累，可導(dǎo)致膜脂過氧化，其最終產(chǎn)物就是丙二醛(MDA)[25]，因此丙二醛含量的多少不僅反映了膜脂過氧化程度，在一定程度上也反映了植物的耐寒能力。11種野生砧木MDA含量在低溫處理下變化趨勢整體上來看，抗寒性強(qiáng)的圍矮2號、Spy227、特大果山定子 MDA含量低且穩(wěn)定，而抗寒性弱的Sdw1、串鈴海棠、圍矮4號MDA含量高，穩(wěn)定性差。何偉[11]等研究表明，抗寒力強(qiáng)的品種MDA含量保持了相對較低水平，而抗寒力較弱品種有著較高水平的MDA含量，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說明低溫處理后MDA含量低且穩(wěn)定是抗寒性的重要指標(biāo)[9]。另外，試驗(yàn)中，MDA含量隨著溫度降低呈雙峰變化趨勢，與閆忠業(yè)[9]等、李遠(yuǎn)發(fā)[24]、劉暢[26]等研究結(jié)果一致，2次MDA含量下降的原因不同，第1次可能與保護(hù)酶系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)啟動了植物應(yīng)急保護(hù)機(jī)制有關(guān)[24,27]，第2次可能與植物細(xì)胞膜生理機(jī)能喪失有關(guān)[26]。

脯氨酸(Pro)含量是植物常用的耐寒性鑒定指標(biāo)，植物體內(nèi)的Pro在正常情況下含量較少而逆境環(huán)境下會異常積累，本研究中，抗寒性較差的圍矮4號、Sdw1、串鈴海棠Pro累積較早，在-20℃下Pro含量便大幅增加(增幅94.8%～134.5%)，說明過早地出現(xiàn)了低溫傷害，與葉艷然[28]等在白穎苔草上的研究結(jié)果相近。關(guān)于Pro含量與植物抗寒性的相關(guān)性報(bào)道很多，但觀點(diǎn)尚不統(tǒng)一[7]，本研究的圍矮2號和特大果山定子抗寒性相對較強(qiáng)，脯氨酸含量明顯高于其他砧木，在一定程度上說明脯氨酸含量與抗寒力強(qiáng)弱呈正相關(guān)性，但7個(gè)溫度間，脯氨酸含量變化趨勢無明顯規(guī)律性，與李淑玲[3]等的研究結(jié)果一致。

植物不同品種在抗寒適應(yīng)性上存在差異，用任何單一的形態(tài)或生理指標(biāo)都很難客觀地比較抗寒性的強(qiáng)弱[19]。所以，國內(nèi)研究者將主成分分析法、聚類分析法、隸屬函數(shù)法等[7-8,19]方法應(yīng)用于植物抗寒性的綜合評價(jià)中，其中隸屬函數(shù)法在果樹上應(yīng)用較多，且效果較好。本研究利用隸屬函數(shù)法對11個(gè)野生砧木品種的相對電導(dǎo)率、MDA、脯氨酸含量進(jìn)行綜合分析，得出其抗寒能力強(qiáng)弱順序?yàn)閲?號>特大果山定子>Spy227>八棱海棠>圍矮3號>克勒溝林場大果山定子>圍矮1號>五峰山4號>串鈴海棠>圍矮4號>Sdw1，與計(jì)算半致死溫度LT50所得抗寒性排序相近，表明該方法適用于蘋果野生砧木資源抗寒性評價(jià)。

植物受凍的損傷程度受降溫速度、低溫時(shí)間長短和解凍快慢等因素影響，而自然界的凍害發(fā)生條件是復(fù)雜多變的，室內(nèi)模擬測定不可能完全反映出自然條件下的凍害情況[29]。但本試驗(yàn)從取材到室內(nèi)低溫模擬條件一致，因此所得結(jié)果在品種間具有可比性。植物抗寒性大小最終反映在生長反應(yīng)上，恢復(fù)生長法是估測植物“真實(shí)”抗寒性的有效選擇，試驗(yàn)結(jié)果中通過隸屬函數(shù)法和LT50所得的抗寒性順序與恢復(fù)生長法萌芽率調(diào)查的結(jié)果總體趨勢一致。因此通過生理指標(biāo)綜合評價(jià)與恢復(fù)生長法相結(jié)合可以用于野生砧木抗寒力的初步比較，對于抗寒性砧木的篩選有參考價(jià)值。