柯思佳 錢春桃 包衛(wèi)紅 倪維晨 李瑞霞

摘 要：自然界中自發(fā)的單倍體發(fā)生概率極低，通過人工的單倍體誘導(dǎo)技術(shù)能夠大大提高單倍體發(fā)生概率。離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體是植物單倍體育種的重要手段之一，重點綜述了近年來通過離體雌核發(fā)育途徑誘導(dǎo)甜瓜單倍體的研究進(jìn)展，包括未授粉子房離體培養(yǎng)途徑和輻射花粉誘導(dǎo)單倍體培養(yǎng)途徑，分別討論了供體基因型、培養(yǎng)基、接種時胚珠的發(fā)育時期、預(yù)處理方式等因素對誘導(dǎo)甜瓜單倍體再生頻率的影響，同時對甜瓜單倍體培養(yǎng)中存在的問題進(jìn)行了分析和討論，并對甜瓜單倍體培養(yǎng)的前景進(jìn)行了展望，以期為接下來甜瓜離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的研究工作提供參考。

關(guān)鍵詞： 甜瓜； 雌核發(fā)育； 單倍體培養(yǎng)； 影響因素

Abstract： The natural spontaneous occurrences frequency of haploid is very low，but it can be significantly increased through artificial haploid induction techniques. In vitro gynogenesis is one of the most important approaches of plant haploid production. The paper reviewed the research progress on producing melon haploid by in vitro gynogenesis，including in vitro culture of unpollinated ovule and haploid induction via irradiated pollen. The effects of factors such as material genotype，medium，the stage of ovule development，pretreatment on haploid regeneration in melon were discussed. Meanwhile，the problems existing in melon haploid culture were analyzed，and the prospects of melon haploid culture were provided for in vitro gynogenesis in melon.

Key words： Melon； In vitro gynogenesis； Haploid culture； Influencing factors

甜瓜（Cucumis melo L.）屬葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，是栽培作物中變異類型最多的作物之一。我國是甜瓜栽培的次生起源中心之一，積累了豐富的甜瓜種質(zhì)資源，現(xiàn)有1 132份，為甜瓜育種工作提供了充足的試材[1-2]。然而，由于常規(guī)育種中甜瓜自交系的選育周期長、工作量大，育種進(jìn)程受到極大限制。如果我們能夠縮短優(yōu)良自交系的選育周期，就可以提高甜瓜雜種一代的育種速度[3]。自1922年Blakeslee[4]首次報道單倍體技術(shù)以來，植物遺傳學(xué)家、植物生理學(xué)家、植物遺傳育種學(xué)家等立即投入了對單倍體的研究。經(jīng)試驗證明，單倍體在植物遺傳研究和育種實踐中均具有重要的價值[5-7]。經(jīng)過離體雌核誘導(dǎo)單倍體技術(shù)，再經(jīng)染色體加倍能迅速獲得純合的雙單倍體植株。利用這項技術(shù)，便可大大加速育種進(jìn)度，獲得新的育種材料，并且節(jié)省人工人力。因此，對于單倍體離體雌核發(fā)育途徑的研究具有重要的意義。

1 未授粉子房離體培養(yǎng)

自San Noeum[8-9]首次在對大麥未授粉的子房培養(yǎng)中得到了單倍體植株以來，學(xué)者們開始在小麥[10]、玉米[11]以及西瓜[12]等不同作物上進(jìn)行未授粉子房的離體培養(yǎng)，未授粉子房離體培養(yǎng)技術(shù)開始成為產(chǎn)生單倍體的一個重要途徑。在葫蘆科作物未授粉子房離體培養(yǎng)的研究中，已經(jīng)在黃瓜[13]、甜瓜[3]、西瓜[12]等植物中獲得了單倍體植株。一般通過未授粉子房離體培養(yǎng)，結(jié)果通常會產(chǎn)生單倍體（H）、雙單倍體及多倍體與非整倍體植株，這幾類植株無論是在植物遺傳學(xué)研究還是在育種實踐中都有很高的利用價值[14]。

在20世紀(jì)90年代，Gemesne等[15]及Ficcadenti等[16]率先對甜瓜未授粉子房離體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行摸索，并成功獲得了甜瓜單倍體植株。21世紀(jì)以后，我國才開始了對甜瓜未授粉離體培養(yǎng)的研究。2004年，韓麗華[17]報道了通過甜瓜未授粉胚珠離體培養(yǎng)成功獲得單倍體植株。隨后王林[3]也開始了甜瓜未授粉胚珠離體培養(yǎng)的研究，但試驗最終僅獲得了叢生芽，分化的叢生芽倍性也有待進(jìn)一步鑒定。2012年牛明明[18]以8個甜瓜雜交種為試驗材料進(jìn)行了離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的試驗，但未能誘導(dǎo)出再生植株。

2 輻射花粉授粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育

1987年，Sauton[19]等首次進(jìn)行了甜瓜輻射花粉授粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究并成功獲得了甜瓜單倍體植株。2002年，查丁石[20]在日本以X射線輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育誘導(dǎo)形成了單倍體胚。隨后，張永兵等[21]、孫玉宏等[22]、薛皓等[23]分別對甜瓜的基因型、培養(yǎng)基、輻射劑量、單倍體植株的加倍等方面進(jìn)行了摸索，并對單倍體甜瓜的加倍進(jìn)行了研究，為接下來我國研究者對甜瓜離體繁殖的研究打下了基礎(chǔ)。

3 影響離體雌核發(fā)育途徑的因素

3.1 基因型

經(jīng)國內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，離體雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的成敗及誘導(dǎo)率的高低與基因型有很重要的關(guān)系。不同基因型的材料其誘導(dǎo)率和出胚率有極顯著差異，并且在同等誘導(dǎo)條件下，特定的基因型只對特定的培養(yǎng)基有反應(yīng)[24]。Ficcadenti等[25]發(fā)現(xiàn)甜瓜不同的正反交組合對單倍體誘導(dǎo)率的影響差異顯著。韓麗華[17]曾誘導(dǎo)了少數(shù)不同甜瓜品種未授粉胚珠，但只有厚皮甜瓜品系‘2B39誘導(dǎo)出單倍體植株。王林[3]發(fā)現(xiàn)甜瓜基因型除了影響離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)效果之外，對其誘導(dǎo)途徑也有影響。牛明明[18]以8個甜瓜雜交種為試驗材料，發(fā)現(xiàn)不同基因型的甜瓜啟動雌核發(fā)育的反應(yīng)率明顯不同。同樣在甜瓜輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育的試驗中，基因型也是一個很關(guān)鍵的因素[26]。薛皓等[23]以48個甜瓜基因型為材料，結(jié)果有18個基因型沒有誘導(dǎo)出再生植株。張永兵等[21]以5種甜瓜基因型為試材，結(jié)果只有其中2種獲得了單倍體植株。牛明明[18]以2個雜交一代‘M1和‘M6為試驗材料進(jìn)行輻射花粉誘導(dǎo)單倍體試驗，最終只有雜交種‘M1獲得再生苗。由此可見，基因型對于雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體技術(shù)有很重要的影響。所以我們在建立通過雌核發(fā)育誘導(dǎo)甜瓜單倍體的再生體系的時候，應(yīng)該擴(kuò)大對基因型的選擇，并且針對每種基因型篩選出其特定的誘導(dǎo)條件，以提高單倍體的誘導(dǎo)率。

3.2 培養(yǎng)基組成

在未授粉子房離體培養(yǎng)試驗中，培養(yǎng)基為外植體的生長發(fā)育提供了所需的營養(yǎng)物資，是人工誘導(dǎo)形態(tài)建成和離體雌核發(fā)育的重要影響因素。培養(yǎng)基對子房培養(yǎng)的影響是多方面的，包括對基本培養(yǎng)基類型的選擇、外源激素種類及濃度等。這些因素之間相互影響，存在一定的交互作用，任何一個因素的改變都可能改變培養(yǎng)基的理化性質(zhì)，從而改變試驗效果。在實際工作中，不同的基因型都有其最適合的培養(yǎng)基，并且某些基因型只有在特定的培養(yǎng)基中才能被成功誘導(dǎo)，這給研究者們的工作增加了很多困難。

基本培養(yǎng)基對單倍體培養(yǎng)的影響很大，目前常見的基本培養(yǎng)基有MS、N6、CBM、White等，或在此基礎(chǔ)上對某些成分略加改良。在葫蘆科作物中，一般MS培養(yǎng)基相對比較適用。此外，外植體在培養(yǎng)過程中通常需要添加一些外源激素才能更好地誘導(dǎo)愈傷組織、胚狀體的形成及芽、根的分化。韓麗華[17]用Zip、BA和IBA等激素成功誘導(dǎo)出了厚皮甜瓜的胚狀體植株。Malik等[27]發(fā)現(xiàn)在甜瓜誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.04 mg·L-1和0.02 mg·L-1的TDZ能明顯增加胚珠愈傷的產(chǎn)生，而0.6 mg·L-1的6-BA激素能明顯增加外植體再生率。王林[3]在改良后的MS培養(yǎng)基上加入不同濃度的TDZ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度TDZ預(yù)培養(yǎng)的胚珠膨大情況隨著誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同而不同。牛明明[18]則發(fā)現(xiàn)啟動雌核發(fā)育的最佳熱激預(yù)處理培養(yǎng)基為：MS+0.04 mg·L-1 TDZ，最佳胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6 mg·L-1 2，4-D+2 mg·L-1 6-BA。通常培養(yǎng)基中也會添加少量附加成分，如AgNO3。Mohiuddin等[28]認(rèn)為，AgNO3通過影響愈傷組織的內(nèi)源激素代謝水平從而影響著葫蘆科植物植株的再生。韓麗華[17]用不同濃度的AgNO3對甜瓜胚珠進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)用80 mg·L-1的AgNO3處理時出胚率最高，為0.74%。此外，除了添加外源激素外，培養(yǎng)基里還應(yīng)該添加碳源，碳源不僅能給外植體提供能量，而且能維持一定的滲透壓[29]。一般來說，蔗糖是最常用的碳源。有研究表明在葫蘆科作物中，碳源濃度在20～40 g·L-1時誘導(dǎo)率較高，并且易于誘導(dǎo)形成單倍體植株[30]。在甜瓜的誘導(dǎo)中蔗糖濃度一般為30 g·L-1[3，17-18]。

在輻射花粉授粉進(jìn)行胚拯救時，胚狀體就已經(jīng)形成，因此在試驗中對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的要求沒有未授粉子房、胚珠培養(yǎng)那么嚴(yán)格，一般選擇E20A或MS培養(yǎng)基[18]。張永兵等[21]將長出綠色胚胎的種子，剝除種皮后轉(zhuǎn)接到MS+0.2 mg·L-1 6-BA培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，最終誘導(dǎo)出2株單倍體再生植株。孫玉宏等[22]將長出綠色胚胎的種子剝?nèi)【G胚后，接種在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養(yǎng)基上生長，誘導(dǎo)29棵植株成苗，其中有11棵為單倍體植株。牛明明[18]和薛皓等[23]則通過試驗發(fā)現(xiàn)在輻射花粉授粉進(jìn)行胚拯救的基本培養(yǎng)基上即使不添加任何外源激素也可以誘導(dǎo)出單倍體植株。

3.3 接種時胚珠的發(fā)育時期

眾多研究結(jié)果表明，接種時胚珠的發(fā)育時期對于未授粉子房離體培養(yǎng)試驗中胚狀體的誘導(dǎo)是一個很重要的因素。大量試驗表明，接近成熟或成熟胚囊時期的子房或胚珠對于誘導(dǎo)雌核發(fā)育比較容易成功，而過于幼嫩的子房[31]或者大孢子時期[32]的子房誘導(dǎo)比較困難。韓麗華[17]、王林[3]等都認(rèn)為對開花前14 h的甜瓜未授粉子房進(jìn)行誘導(dǎo)，效果最好。牛明明[18]在開花前2 d、開花前1 d以及開花當(dāng)天分別選取甜瓜未授粉子房進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時期的子房誘導(dǎo)效果差異顯著，開花前1 d的子房培養(yǎng)效果最好，開花前2 d的次之，開花當(dāng)天的最差。

3.4 預(yù)處理

在接種前通常要對材料進(jìn)行黑暗、變溫等預(yù)處理，通過改變細(xì)胞的生理狀態(tài)、分裂方式及發(fā)育途徑，從而提高雌核發(fā)育的誘導(dǎo)率。在葫蘆科作物中，一般對材料進(jìn)行4 ℃的低溫預(yù)處理。Metwally等[33]認(rèn)為甜瓜在4 ℃低溫下處理36 h誘導(dǎo)效果較好。Malik等[27]認(rèn)為4 ℃低溫培養(yǎng)4 d可以有效提高甜瓜出胚率。但是在我國，更多的是對甜瓜進(jìn)行不同時間的熱激處理。韓麗華[17]、王林[3]等認(rèn)為甜瓜最佳培養(yǎng)條件為35 ℃暗培養(yǎng)4 d。牛明明[18]通過研究發(fā)現(xiàn)，30 ℃黑暗條件下熱激3 d雌核發(fā)育的誘導(dǎo)率最高。

3.5 輻射源及輻射劑量

在輻射花粉授粉誘導(dǎo)單倍體試驗中，輻射源及輻射劑量的選擇是成功的關(guān)鍵。它受作物種類、植物生長期、輻射器官等多種因素的影響，適宜輻射劑量的選擇是一個長期的過程，但研究者們已經(jīng)摸索到一定的規(guī)律。實踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量的標(biāo)準(zhǔn)，在未到達(dá)臨界致死劑量以前，單倍體的誘導(dǎo)頻率隨劑量的升高而增加。此外，輻射劑量與植物的倍性及花粉粒的大小也有關(guān)，倍性越高，花粉粒越小，越耐輻射。Faris等[34]認(rèn)為Co60所產(chǎn)生的γ射線是葫蘆科作物輻射花粉授粉誘導(dǎo)單倍體的有效輻射源。甜瓜的輻射劑量較常用的是500～2 500 Gy[19]。張永兵等[21]在300 Gy時成功誘導(dǎo)出了單倍體植株，而劑量為600 Gy時未能誘導(dǎo)供試材料形成單倍體。而牛明明[18]卻得到了相反的結(jié)論。孫玉宏等[22]發(fā)現(xiàn)在300、500、750和1 000 Gy幾個劑量中，以750 Gy劑量輻射處理的效果最好。薛皓等[23]則發(fā)現(xiàn)800 Gy的輻射劑量能使甜瓜的坐果率和再生植株的誘導(dǎo)率都達(dá)到相對較高的水平。所以在試驗中在實際操作中，我們需要針對不同基因型的甜瓜做不同的輻射處理，從而確定適宜的輻射劑量，不能一概而論。除了Co60所產(chǎn)生的γ射線外，也有一些學(xué)者用X射線輻射花粉，如Yashiro等[35]利用X射線（67.08 C·kg-1）輻射花粉，在5個甜瓜基因型上成功誘導(dǎo)出單倍體胚。查丁石[20]也利用650 Gy的軟X射線照射獲得了甜瓜單倍體植株。

3.6 花粉輻射

據(jù)研究表明，植物生長過程中，適宜的溫、濕度可以得到高單倍體發(fā)生率。針對葫蘆科作物，通常在開花前1 d對雄花進(jìn)行輻射處理后保存在低溫（4 ℃）干燥條件下，第2天再給母株授粉。一般來說，高的輻射劑量可以提高胚的誘導(dǎo)率。但是在到達(dá)雌核發(fā)育臨界致死劑量之前，低溫貯存的時間越長，經(jīng)高劑量輻射過的花粉活力喪失越快，而且可產(chǎn)生較高的花粉萌發(fā)率，這樣反而會降低單倍體植株的發(fā)生率。所以在實際操作過程中，盡量在雄花進(jìn)行輻射處理后立即授粉，從而提高單倍體的誘導(dǎo)率。而且在授粉過程中，每朵雌花需用3～4朵輻射過的雄花授粉，這樣不僅可以增加花粉管到達(dá)胚囊的數(shù)量，而且可以更加有效地促進(jìn)雌核發(fā)育[19，36]。

3.7 胚拯救

在輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育過程中，種子中敗育胚的比例很高，所以必須及時進(jìn)行胚拯救。過早或過晚地進(jìn)行胚拯救都會大大影響胚拯救的效果。Sauton[19，37]等通過試驗發(fā)現(xiàn)甜瓜幼胚授粉后3周后在MS+0.2 mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養(yǎng)基上進(jìn)行胚拯救，可以提高單倍體胚的誘導(dǎo)效率。薛皓[23]在授粉后3～4周采收果實進(jìn)行胚拯救，誘導(dǎo)出正常發(fā)育的胚。張永兵等[21]和牛明明[18]在授粉4～5周進(jìn)行胚拯救，結(jié)果都得到了單倍體植株。以上試驗表明，甜瓜輻射授粉后3～5周做進(jìn)行胚拯救，可以大大提高單倍體胚的誘導(dǎo)效率，此時多數(shù)胚為心形胚時可以獲得高單倍體誘導(dǎo)率。但是孫玉宏等[22]通過試驗發(fā)現(xiàn)，授粉后12 d為甜瓜胚拯救的最佳時間。這可能是因為特異的甜瓜基因型其胚敗育的進(jìn)程不一樣，需要針對具體基因型具體分析。Custers等[38]通過研究發(fā)現(xiàn)，幼胚發(fā)育到心形胚階段在適宜的培養(yǎng)基（E20A培養(yǎng)基含0.01 mg·L-1 IAA）上進(jìn)行胚拯救，可以大大提高單倍體胚的誘導(dǎo)率。而且Kurtar等[39]通過倍性鑒定，僅有53.8%魚雷形胚和23.1%的心形胚發(fā)育成單倍體，其余的則發(fā)育成雙單倍體。

3.8 其他因素

除了上述因素，植物的生理狀態(tài)及接種方式等因素都會對甜瓜離體雌核發(fā)育產(chǎn)生影響。

植物的生理狀態(tài)受栽培的季節(jié)及所處的生長環(huán)境決定，對于離體雌核發(fā)育的誘導(dǎo)率和出胚率有一定的影響。趙曉菲[40]在對不同栽培季節(jié)的西葫蘆子房進(jìn)行誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，胚狀體誘導(dǎo)率存在著極顯著性差異，其中秋季最高，其次是夏季，春季最低。王林[3]發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)條件下春季的胚珠污染率明顯高于秋季。然而韓麗華[17]在5月下旬進(jìn)行甜瓜單倍體培養(yǎng)得到了單倍體植株，但是8月份同樣的方法卻未得到。

子房或胚珠不同的消毒方式和切割方式也影響著胚狀體的誘導(dǎo)頻率。陳玲[41]、閔子揚(yáng)[42]等認(rèn)為先切片再消毒比先消毒再切片更有利于未授粉子房進(jìn)行離體雌核誘導(dǎo)。陳玲[41]和陳學(xué)軍等[43]認(rèn)為在子房橫切、縱切、切啄、完整胚珠4種切割方式中，橫切最有利于離體雌核發(fā)育的誘導(dǎo)。并且在培養(yǎng)基上，外植體的擺放也是有依據(jù)的，它會因為外植體的切分方式不同而不同，也會因為作物種類的不同而異。在黃瓜雌核發(fā)育誘導(dǎo)單倍體的試驗中，Gemesne等[15]采用分離出胎座條平放在培養(yǎng)基上的方式進(jìn)行接種，蘇芃[44]則是切取1 mm厚的子房薄片平放在培養(yǎng)基上。孫松松[45]在對西葫蘆未授粉子房離體培養(yǎng)的試驗中，先去掉子房的外表皮，再切為1～1.5 mm的薄片平放在培養(yǎng)基上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。謝冰等[46]則是從未授粉的西葫蘆子房中剝?nèi)⊥耆呐咧榻臃N在培養(yǎng)基上，這種方式更有利于胚珠吸收營養(yǎng)，誘導(dǎo)效果更好，觀察起來也更方便。韓麗華[17]在甜瓜未受精胚珠離體培養(yǎng)的研究中，通過比較剝胚珠法分離出胎座和橫切為0.3～0.5 mm的薄片這2種接種方式后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)切片培養(yǎng)的胚珠，胎座組織對胚珠的生長有抑制作用，導(dǎo)致胚珠競爭不到營養(yǎng)，珠被發(fā)生愈傷化。

4 甜瓜單倍體培養(yǎng)存在的問題與未來研究的重點

雖然通過離體雌核發(fā)育途徑獲得甜瓜單倍體技術(shù)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是在實際培養(yǎng)過程中還是存在著很多問題。胚狀體的誘導(dǎo)率、成苗率很低，重復(fù)性差，至今未能建立起一套重現(xiàn)性好的培養(yǎng)體系，這些都嚴(yán)重影響著試驗進(jìn)程。而這主要是因為以下幾點：一、基因型依賴性強(qiáng)。二、培養(yǎng)過程受多種因素相互影響。三、愈傷組織誘導(dǎo)率及分化率低。在今后的研究中，如何優(yōu)化試驗技術(shù)，提高誘導(dǎo)率從而建立穩(wěn)定可重復(fù)的甜瓜單倍體培養(yǎng)體系依然是研究的重點。

目前在玉米單倍體育種中，報道了一個名為MATRILINEAL（MTL）的玉米花粉特異性磷脂酶基因[47-48]。據(jù)研究表明，該基因突變后能誘導(dǎo)玉米單倍體的形成，且在其他作物中具有保守性。隨后，有研究發(fā)現(xiàn)水稻中的玉米MTL同源基因OSMATL經(jīng)CRISPR-Cas9技術(shù)突變后可以誘導(dǎo)單倍體種子的形成[49]。所以在今后對甜瓜單倍體的研究中，應(yīng)該在甜瓜中找到類似的同源基因來誘導(dǎo)甜瓜單倍體的形成，解決目前甜瓜單倍體育種中基因依賴性強(qiáng)的一大難題。

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