邵長(zhǎng)山 徐深秋 余淦 肖俊

目前，對(duì)于膀胱腫瘤的治療，手段多樣，但療效還有待提高，迫切需要新的治療方式來(lái)補(bǔ)充，深入研究膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)機(jī)制具有重要臨床意義。已經(jīng)有大量研究報(bào)道m(xù)icroRNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，miR-199a-3p作為microRNAs的一種多通過(guò)直接作用于靶基因調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)而影響不同病理生理進(jìn)程[1-2]。 CDK7作為依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶成員之一，在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面有重要作用，且有研究報(bào)道其與腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性相關(guān)。有研究認(rèn)為miR-199a-3p可以作為膀胱腫瘤的預(yù)后因子[3-5]，至于miR-199a-3p及其與CDK7的相互作用如何影響膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，暫未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。有研究報(bào)道m(xù)iR-199a-3p可以通過(guò)靶向DDR1影響卵巢腫瘤的藥物敏感性[6]；并發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可以通過(guò)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA相互作用影響CDK7的表達(dá)；還可通過(guò)調(diào)節(jié)Smad1的表達(dá)水平從而調(diào)節(jié)前列腺癌的生物學(xué)行為[7-8]。此外還有關(guān)于miR-199a-3p在人類其他腫瘤中的研究報(bào)道，包括肝癌[9]及乳腺癌[10]等；并發(fā)現(xiàn)其可能還參與乙肝病毒感染導(dǎo)致疾病的進(jìn)程以及腫瘤干細(xì)胞的形成和發(fā)展[11-12]。本研究對(duì)CDK7是否可以作為miR-199a-3p的靶標(biāo)基因以及兩者共同調(diào)節(jié)膀胱腫瘤發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

材料與方法

一、材料、試劑

11對(duì)膀胱腫瘤組織及其腫瘤旁正常組織來(lái)自湖北省京山縣人民醫(yī)院泌尿外科以及華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，手術(shù)切除后15 min內(nèi)收集標(biāo)本并置于液氮或者-80 ℃冰箱中保存。膀胱腫瘤細(xì)胞系T24及EJ細(xì)胞(購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))，CDK7及內(nèi)參抗體(購(gòu)自O(shè)RGENTEC公司)，細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清(購(gòu)自hyclone公司)，質(zhì)粒構(gòu)建及miR-199a-3p抑制劑和類似物(購(gòu)自上海吉碼制藥技術(shù)有限公司)，引物合成(湖北晶茂公司)。PCR儀及RNA濃度測(cè)量?jī)x(購(gòu)自美國(guó)Thermo公司及NanoDrop公司)，PCR相關(guān)器材(購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司)，其他相關(guān)器材(購(gòu)自湖北晶茂公司等)。

二、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

T24及EJ細(xì)胞均采用10%的胎牛血清培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%傳代，培養(yǎng)條件為37 ℃含5% CO2，傳代換液必要時(shí)可予以離心。待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合度為70%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染，本項(xiàng)目轉(zhuǎn)染體系以6孔板的轉(zhuǎn)染體系舉例說(shuō)明，其他轉(zhuǎn)染體系根據(jù)這個(gè)體系酌情增減。用opti-MEM 100 μl 培養(yǎng)液稀釋miR-199a-3p抑制劑或類似物和轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體8 μl，移液槍充分混勻后全部組合到1個(gè)EP管中靜置15 min，后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中，整個(gè)培養(yǎng)體系容積為2 ml，轉(zhuǎn)染48～72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR

Trizol提取細(xì)胞總RNA。實(shí)驗(yàn)所用組織碾磨器具用DEPC水浸泡過(guò)夜后高壓滅菌烘干，準(zhǔn)備好無(wú)RNA酶槍頭、無(wú)RNA酶離心管、異丙醇、三氯甲烷以及乙醇和低溫離心機(jī)等。加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞或組織，15 min后于上述無(wú)RNA酶EP管中加入三氯甲烷0.2 ml，用振蕩器震蕩15 s后室溫狀態(tài)下靜置5 min，于4 ℃離心機(jī)12 000 g離心10 min；取出EP管并仔細(xì)轉(zhuǎn)移出上清至新的無(wú)RNA酶 EP管中，再加入0.5 ml異丙醇并輕輕混勻，常溫下放置10 min后于4 ℃離心機(jī)12 000 g離心10 min；棄上清，加入1 ml 0 ℃的75%乙醇洗滌沉淀后于4 ℃離心機(jī)7 500 g離心5 min，棄上清；常溫放置約5～10 min揮發(fā)多余水和酒精，注意避免完全干燥，加入30 μl 無(wú)RNA酶純水溶解RNA；最后將RNA樣品于55 ℃水浴鍋中變性10 min，待冷卻至室溫后測(cè)RNA樣品額純度及濃度備用。實(shí)時(shí)定量PCR體系根據(jù)Fermantas試劑盒提供的說(shuō)明進(jìn)行操作，反應(yīng)條件根據(jù)引物退火溫度適當(dāng)調(diào)整。

四、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

分別將T24及EJ細(xì)胞種植于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右的細(xì)胞融合度，根據(jù)上述轉(zhuǎn)染體系調(diào)整24孔板所需要的轉(zhuǎn)染體系，轉(zhuǎn)染48 h后Dual-LuciferaseTMReporter Assay System檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性，記錄并分析。

五、增殖實(shí)驗(yàn)

MTS試劑與細(xì)胞培養(yǎng)液按照10∶1比例添加，預(yù)混合，細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束48 h后消化細(xì)胞,將細(xì)胞種植于96孔板中，每孔2 000個(gè)細(xì)胞，體系為200 μl，種植96孔板設(shè)計(jì)6個(gè)復(fù)孔，并在種植細(xì)胞孔周圍覆蓋PBS溶液以防培養(yǎng)液揮發(fā)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)分別在加入了MTS無(wú)血清培養(yǎng)液孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，記錄并分析數(shù)據(jù)。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。兩組之間的比較整體數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的選用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-199a-3p、CDK7在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)及其相關(guān)性

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，11對(duì)新鮮膀胱腫瘤組織中有10對(duì)miR-199a-3p的表達(dá)較相應(yīng)正常對(duì)照組織顯著下降，且絕大部分表達(dá)減少達(dá)80%以上，1對(duì)腫瘤組織和對(duì)照組織表達(dá)水平無(wú)明顯差異，但是總體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1A。除了1對(duì)組織中CDK7表達(dá)無(wú)明顯差異外，其余10對(duì)膀胱腫瘤組織中CDK7的表達(dá)均較正常對(duì)照組織顯著升高，絕大部分升高了4倍以上，總體數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖1B。miR-199a-3p和CDK7表達(dá)無(wú)明顯差異者并非同1對(duì)膀胱腫瘤組織，相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，11對(duì)膀胱腫瘤組織中miR-199a-3p和CDK7的表達(dá)呈負(fù)性相關(guān)(P=0.040 4,R2=0.338 7)。見(jiàn)圖1C。

A:11對(duì)新鮮膀胱腫瘤組織與對(duì)照組織中miR-199a-3p的基礎(chǔ)表達(dá)水平;B:11對(duì)新鮮膀胱腫瘤組織與對(duì)照組織中CDK7的基礎(chǔ)表達(dá)水平;C:miR-199a-3p和CDK7在膀胱腫瘤組織中表達(dá)的相關(guān)性

圖1 膀胱腫瘤組織中miR-199a-3p和CDK7的表達(dá)及其相關(guān)性分析

二、miR-199a-3p對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖作用的影響

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物(miR-199a-3p mimics) 3 d后，miR-199a-3p的表達(dá)較對(duì)照組(mimics NC)顯著上升，均達(dá)10倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2A。T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 抑制劑(miR-199a-3p inhibitor)后，miR-199a-3p的表達(dá)較對(duì)照組(inhibitor NC)則出現(xiàn)了明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2B。驗(yàn)證轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有效。轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后T24和EJ細(xì)胞的增殖均受到了明顯的抑制，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)的抑制率分別為33.65%和39.12%；同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 抑制劑后T24和EJ細(xì)胞的增殖得到明顯增強(qiáng)，細(xì)胞增殖能力在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)分別提高了13.94%和11.69%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2C、2D。

A：T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后，miR-199a-3p的表達(dá)；B：T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 抑制劑后， miR-199a-3p的表達(dá)；C：T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后，細(xì)胞增殖能力下降，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 抑制劑后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；D：EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后，細(xì)胞增殖能力下降，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 抑制劑后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)

圖2 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證及膀胱腫瘤細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

三、miR-199a-3p對(duì)CDK7蛋白水平的影響

在T24細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染CDK7野生型3′UTR(WT 3′UTR )后miR-199a-3p 類似物熒光素酶活性下降了27.55%，而在共轉(zhuǎn)染CDK7突變型3′UTR (MUT 3′UTR )后熒光素酶活性無(wú)明顯改變；共轉(zhuǎn)染CDK7 WT 3′UTR后miR-199a-3p 抑制劑熒光素酶活性上升了16.57%，而在共轉(zhuǎn)染CDK7 MUT 3′UTR后熒光素酶活性無(wú)明顯改變,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3A。熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)CDK7可以作為miR-199a-3p的靶標(biāo)基因。在EJ細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染CDK7 WT 3′UTR后miR-199a-3p 類似物熒光素酶活性下降了15.68%，而在共轉(zhuǎn)染CDK7 MUT 3′UTR后熒光素酶活性無(wú)明顯改變；共轉(zhuǎn)染CDK7 WT 3′UTR后miR-199a-3p 抑制劑熒光素酶活性上升了24.53%，而在共轉(zhuǎn)染CDK7 MUT 3′UTR后熒光素酶活性無(wú)明顯改變,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3B。miR-199a-3p種子序列可以與CDK7 3′端非翻譯區(qū)以堿基互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合。見(jiàn)圖3C。免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示在EJ和T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后， CDK7的表達(dá)顯著下降。見(jiàn)圖3D。

A：在T24細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 WT 3′UTR后熒光素酶活性下降，轉(zhuǎn)染MUT 3′UTR后熒光素酶活性無(wú)明顯改變;B：在EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 WT 3′UTR后熒光素酶活性下降，轉(zhuǎn)染MUT 3′UTR后熒光素酶活性無(wú)明顯改變；C：種子序列堿基互補(bǔ)配對(duì)位點(diǎn)；D：T24和EJ細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p 類似物后CDK7的翻譯水平的變化

圖3 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、配對(duì)位點(diǎn)及免疫印跡實(shí)驗(yàn)

四、CDK7可以回復(fù)或者部分回復(fù)miR-199a-3p對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

相對(duì)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-199a-3p類似物，在T24細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-199a-3p類似物和CDK7后，膀胱腫瘤細(xì)胞增殖能力提高了42.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4A。在EJ中重復(fù)同樣的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-199a-3p類似物和CDK7后，相對(duì)于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-199a-3p類似物，膀胱腫瘤細(xì)胞增殖能力提高了45.49%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖4B。

A：T24；B：EJ

圖4 功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)

討 論

膀胱腫瘤是我國(guó)人群中泌尿系腫瘤發(fā)病率第一位的腫瘤，對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)詳細(xì)的研究尤為重要。近些年，雖然推出了多種新的膀胱腫瘤的治療方式，但是很多病例的治療效果并不十分理想。microRNA作為體內(nèi)重要的非編碼RNA，大量研究證明其在人類腫瘤中有重要的調(diào)節(jié)功能，其經(jīng)典作用機(jī)制是通過(guò)與靶標(biāo)基因相結(jié)合降解靶標(biāo)基因的信使RNA或者影響信使RNA的翻譯，從而影響靶標(biāo)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響病理生理進(jìn)程。本研究首先在膀胱腫瘤組織中分別檢測(cè)了miR-199a-3p和CDK7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p的表達(dá)減低，同時(shí)CDK7的表達(dá)升高，且二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，部分腫瘤組織中miR-199a-3p和CDK7的表達(dá)無(wú)明顯變化，說(shuō)明其在膀胱腫瘤中的表達(dá)存在一定的變異性。了解了miR-199a-3p的表達(dá)模式后我們進(jìn)一步研究了miR-199a-3p在膀胱腫瘤中的功能作用，通過(guò)過(guò)表達(dá)和降低miR-199a-3p的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其可以明顯抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖，說(shuō)明miR-199a-3p在膀胱腫瘤中起著抑癌基因樣作用。接著通過(guò)熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)miR-199a-3p可以直接靶向CDK7的3′端非翻譯區(qū)，同時(shí)免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-199a-3p可以在翻譯水平降低CDK7的表達(dá)，說(shuō)明miR-199a-3p抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖可能是通過(guò)靶向CDK7實(shí)現(xiàn)的。最后通過(guò)功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證。

綜上所述，miR-199a-3p通過(guò)直接靶向CDK7，實(shí)現(xiàn)其在膀胱腫瘤中的腫瘤抑制基因樣作用，抑制膀胱腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究進(jìn)一步豐富了膀胱腫瘤的生物學(xué)理論。