金藝?guó)P 田 靜 王 瑩 焦南林 汪向海 邢 敏

(皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院呼吸與危重癥科，安徽 蕪湖 241001)

肝激酶(LK)B1作為抑癌基因，也被稱為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶11，定位于19p13.3。LKB1缺失可破壞上皮細(xì)胞極性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。研究顯示乳腺癌患者低LKB1蛋白表達(dá)水平與較差的總生存期(OS)相關(guān)〔1〕；人類表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)2陽性乳腺癌患者低LKB1蛋白表達(dá)水平是OS的潛在預(yù)測(cè)因子〔2〕。研究表明非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者LKB1蛋白表達(dá)缺失的患者預(yù)后較差，且LKB1低表達(dá)水平與臨床病理特征相關(guān)〔3〕。本研究探討LKB1在NSCLC患者中的表達(dá)情況及與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1材料 總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒、SYBR Green染料均購自Takara 公司。LKB1抗體為兔抗人的多克隆抗體購自Proteintech公司,內(nèi)參GAPDH抗體購自Biosharp公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Jackson Immuno公司。石蠟包埋組織提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2病理標(biāo)本 選擇2014年2月至2016年8月在皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胸外科行肺癌切除術(shù)的患者23例，經(jīng)病理確診為NSCLC(鱗癌10例、腺癌13例)，同時(shí)選擇距癌腫邊緣5 cm以上的正常肺組織，經(jīng)病理證實(shí)無轉(zhuǎn)移。23例NSCLC患者進(jìn)行術(shù)后無進(jìn)展生存期(PFS)隨訪，隨訪截止至2016年12月28日。至截止日共18例肺癌組織標(biāo)本資料完整、有隨訪結(jié)果。NSCLC患者根據(jù)第8版國(guó)際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)修訂稿〔4〕進(jìn)行分期，術(shù)前均未接受過放化療及免疫治療。根據(jù)23例NSCLC患者LKB1基因蛋白、mRNA表達(dá)的中位水平(0.534、0.227 3)分成兩組；蛋白低表達(dá)組12例，高表達(dá)組11例；mRNA低表達(dá)組13例，高表達(dá)組10例。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 細(xì)胞總RNA按Trizol試劑盒說明書提取并定量。取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。在RT-PCR儀器上進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參。LKB1反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，LKB1基因上游引物為5′-CATGACTGTGGTGCCGTACT-3′，下游引物為5′-GTGACTGGCCTCCTCTTCTG-3′；β-actin的上游引物為5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物為5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′，基因的表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

1.4Western印跡實(shí)驗(yàn) 提取石蠟包埋組織中的蛋白質(zhì)，把含30 μg蛋白質(zhì)樣品液與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳樣品緩沖液混合后，在沸水中煮沸5 min變性后，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)好的PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中4℃孵育過夜，加入封閉液稀釋的LKB1一抗(1∶1 000)，以GAPDH(1∶1 000)為內(nèi)參，室溫孵育2 h，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；再加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次10 min，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)生顯影。Tanon GIS 1D4.2圖像分析軟件分析。用軟件ImageJ 1.37v對(duì)目標(biāo)條帶的光密度值進(jìn)行分析處理并記錄。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行單因素方差

分析、LSD-t檢驗(yàn)、Kaplan-Meier法分析。

2 結(jié) 果

2.1LKB1基因蛋白及mRNA表達(dá)水平 肺癌組織LKB1基因蛋白表達(dá)(0.600±0.182)和mRNA表達(dá)(0.322±0.215)顯著低于癌旁正常組織LKB1基因蛋白表達(dá)(1.114±0.951)和mRNA表達(dá)(1.086±0.446)(P<0.05)。見圖1。

1～6為6例NSCLC患者圖1 各組LKB1基因蛋白表達(dá)

2.2LKB1基因蛋白、mRNA表達(dá)水平與臨床病理關(guān)系 LKB1蛋白、mRNA表達(dá)年齡、臨床分期、腫瘤大小患者中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在不同分化程度患者中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表1。

2.3LKB1基因蛋白、mRNA表達(dá)水平與NSCLC患者PFS的關(guān)系 LKB1基因蛋白低表達(dá)組中位PFS〔9.07(95%CI:5.80～12.34)個(gè)月〕明顯短于高表達(dá)組〔15.36(95%CI:12.52～18.20)個(gè)月〕(P=0.006)。LKB1基因mRNA低表達(dá)組根據(jù)LKB1基因mRNA表達(dá)的中位水平(0.2273)分組中位PFS〔8.20(95%CI:6.29～10.11)個(gè)月〕明顯短于高表達(dá)組〔16.57(95%CI:11.20～21.94)個(gè)月〕(P=0.000)，見圖2、3。

表1 LKB1基因蛋白、mRNA表達(dá)與臨床病理關(guān)系

圖2 LKB1基因蛋白表達(dá)水平與PFS的關(guān)系

圖3 LKB1基因mRNA表達(dá)水平與PFS的關(guān)系

3 討 論

LKB1幾乎在所有組織中都有表達(dá)，參與多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞結(jié)構(gòu)控制、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞代謝〔5〕。作為多功能蛋白，LKB1基因是腺苷磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路的主要上游激酶，也是細(xì)胞代謝中維持能量平衡的必需元素。LKB1通過激活一組與AMPK相關(guān)的激酶來發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用，通過LKB1激活A(yù)MPK相關(guān)的激酶在維持細(xì)胞極性、抑制癌細(xì)胞的異常生長(zhǎng)起著至關(guān)重要的作用〔6〕。研究表明LKB1作為抑癌基因，通過激活A(yù)MPK通路或AMPK相關(guān)的激酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞極性和新陳代謝〔7〕。

LKB1基因在NSCLC常表現(xiàn)為表達(dá)缺失或失活突變，且LKB1表達(dá)缺失與肺癌發(fā)展、腫瘤分化、侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)〔8〕。李作生等〔9〕研究顯示LKB1基因蛋白的陽性表達(dá)率在高分化組、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于中-低分化組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，認(rèn)為L(zhǎng)KB1低表達(dá)可能影響肺癌的預(yù)后。李洋等〔10〕檢測(cè)了74例肺癌組織的LKB1、人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LKB1表達(dá)缺失與肺癌侵襲、臨床分期相關(guān)，而與性別、年齡、病理類型無關(guān)，認(rèn)為檢測(cè)其蛋白表達(dá)可作為NSCLC預(yù)后的判斷依據(jù)。Xiao等〔11〕對(duì)14篇文獻(xiàn)共1 915例實(shí)體瘤患者進(jìn)行Meta分析，結(jié)果顯示實(shí)體瘤患者低LKB1表達(dá)水平與預(yù)后較差相關(guān)，可作為臨床病理預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)因子。但也有研究〔12〕顯示LKB1在細(xì)胞內(nèi)位置不同臨床意義也不同，乳腺癌患者細(xì)胞質(zhì)LKB1高表達(dá)水平與OS和DFS顯著下降相關(guān)，是預(yù)后較差的獨(dú)立預(yù)后因子；而細(xì)胞核LKB1高表達(dá)水平與OS和DFS顯著增加相關(guān)。

本研究說明LKB1基因的表達(dá)異常在肺腺癌和鱗癌中均存在。LKB1基因的表達(dá)降低可能導(dǎo)致對(duì)腫瘤的抑制作用減弱，進(jìn)而使腫瘤的惡性程度增加。但本研究中LKB1基因的表達(dá)高低與年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤大小無關(guān)，可能與樣本數(shù)較少有關(guān)，在今后研究中將加大樣本量進(jìn)一步研究。但由于隨訪時(shí)間較短，對(duì)OS無法作出評(píng)估，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，LKB1基因表達(dá)水平與NSCLC的組織分化程度相關(guān)，且LKB1低表達(dá)可能提示預(yù)后不良。