孫曉偉

角膜堿燒傷引發(fā)的炎癥是導(dǎo)致角膜新生血管化的重要原因, 角膜組織內(nèi)的壞死物質(zhì)能夠趨化巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤, 浸潤的炎癥細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子, 進(jìn)一步加重組織的溶解壞死, 發(fā)生潰瘍甚至穿孔, 并能引起角膜新生血管發(fā)育［1,2］。新生血管化的角膜混濁不但會嚴(yán)重影響視力, 而且會破壞角膜免疫赦免的屬性。目前對于角膜堿燒傷治療最簡便有效的手段還是應(yīng)用激素類抗炎藥物, 然而激素的應(yīng)用具有加速角膜溶解穿孔、誘發(fā)青光眼的風(fēng)險, 因此尋找毒副作用低、療效好、應(yīng)用方便的藥物是目前該領(lǐng)域研究的有益方向。

1 資料與方法

1.1 動物和實(shí)驗(yàn)試劑 C57BL/6小鼠, 6～8周, 平均體重為(20±2)g, 來源于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物中心。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；磷酸鹽緩沖液；兔抗小鼠CD68單克隆一抗(美國Abcam公司)；山羊抗小鼠CD31單克隆一抗(美國Abcam公司)；驢抗兔488熒光二抗；驢抗山羊555熒光二抗；鹽酸丙美卡因滴眼液(蘇州工業(yè)園區(qū)天龍制藥有限公司)；妥布霉素眼膏(西班牙ALCON CUSI, S.A)；三溴乙醇(日本TCI)；阿佛丁溶劑叔戊醇(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 6～8周健康小鼠24只, 隨機(jī)分為PBS對照組和FA治療組, 每組12只。所有小鼠飼養(yǎng)和使用均遵從美國眼科與視覺科學(xué)協(xié)會的眼科實(shí)驗(yàn)研究動物管理?xiàng)l例［3］。

1.2.2 小鼠角膜堿燒傷模型制作 小鼠腹腔注射1.2%阿佛丁麻醉, 用量為200 μl/10 g, 鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼行表面麻醉。將直徑2 mm的濾紙片置于裝有0.5 mol/L 氫氧化鈉的小培養(yǎng)皿中充分浸泡, 用鑷子夾取濾紙覆蓋在角膜上30 s, 棄去濾紙, 用30～50 ml生理鹽水沖洗角膜和結(jié)膜囊, 用手術(shù)刀輕輕刮去角膜上皮, 涂妥布霉素眼膏, 復(fù)蘇后常規(guī)飼養(yǎng), 建模當(dāng)天為Day0(D0), 將FA粉末用PBS溶液溶解, 配制成5 mg/ml的阿魏酸滴眼液, 滴FA滴眼液或者PBS溶液, 2次/d, 5 μl/次,D7時取材。

1.2.3 角膜組織免疫熒光染色 取小鼠眼球多聚甲醛固定1 h, 將完整的角膜剪下, 保留角膜緣組織, 牛血清白蛋白封閉角膜12 h。4℃孵育山羊抗小鼠CD31(新生血管標(biāo)記物)抗體和兔抗小鼠CD68(巨噬細(xì)胞標(biāo)記物)抗體24 h。PBS漂洗后, 孵育驢抗兔488熒光二抗和驢抗山羊555熒光二抗2 h。Leika共聚焦顯微鏡拍片, 用CD68免疫熒光染色統(tǒng)計巨噬細(xì)胞個數(shù), ImageJ軟件計算角膜新生血管面積, 用CD31免疫熒光染色計算新生血管區(qū)域占整個角膜的百分比。

1.2.4 角膜組織聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測 取同組的兩個角膜組織放入1 ml Trizol, 試劑盒提取角膜組織核糖核酸(RNA), 逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)。構(gòu)建Real time PCR反應(yīng)體系及循環(huán)參數(shù)：20 μl 反應(yīng)體系包括2 μl cDNA,10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq, 7 μl ddH2O以及10 μmol/L引物,Real time PCR循環(huán)參數(shù)先95℃ 30 s預(yù)變性, 95℃ 5 s、60℃34 s 進(jìn)行40個循環(huán)。各個樣本信使核糖核酸(mRNA)含量依照各自的D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化, 利用2-△△CT法對IL-6、CCL2和MMP-9基因相對表達(dá)予以分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析, 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用t檢驗(yàn),p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸明顯減少堿燒傷角膜新生血管生長及炎癥細(xì)胞浸潤的影響 應(yīng)用FA后角膜組織新生血管的生長被明顯抑制, FA治療組新生血管面積低于PBS對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。FA治療組巨噬細(xì)胞浸潤明顯減少, FA治療組巨噬細(xì)胞數(shù)量少于PBS對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表 1。

2.2 阿魏酸下調(diào)堿燒傷角膜組織促炎因子表達(dá) 發(fā)現(xiàn)FA能夠明顯抑制角膜組織中IL-6、CCL2和MMP-9基因的表達(dá),FA治療組的IL-6、CCL2以及MMP-9均少于PBS對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。見表2。

表1 FA治療組和PBS對照組角膜新生血管面積和巨噬細(xì)胞浸潤的比較

表1 FA治療組和PBS對照組角膜新生血管面積和巨噬細(xì)胞浸潤的比較

注：與PBS對照組比較, ap＜0.05

組別 只數(shù) 新生血管面積(%) 巨噬細(xì)胞數(shù)量(105個/g)PBS對照組 6 50.12±8.56 86.75±5.10 FA治療組 6 31.12±5.88a 46.67±4.20a t 4.481 14.860 p＜0.05 ＜0.05

表2 FA治療組和PBS對照組角膜組織促炎因子表達(dá)的比較

表2 FA治療組和PBS對照組角膜組織促炎因子表達(dá)的比較

注：與對照組比較, ap＜0.05

組別 只數(shù) IL-6(pg/ml) CCL2(ng/ml) MMP-9(ng/ml)PBS 對照組 6 5.32±0.46 17.12±1.56 10.32±0.73 FA治療組 6 3.12±0.37a 12.45±1.15a 5.11±0.58a t 9.128 5.902 13.688 p＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

角膜是屈光系統(tǒng)的重要組成部分, 維持角膜的無血管狀態(tài)對于保持角膜透明性、低免疫源性具有重要的生理意義。堿燒傷角膜組織早期以局部組織強(qiáng)烈的炎癥為特征, 過度的炎癥細(xì)胞浸潤及細(xì)胞因子表達(dá)會使組織中促新生血管及抑制新生血管機(jī)制失衡。本研究針對炎癥促發(fā)角膜新生血管生成這一角度開展研究, 首次利用FA治療角膜堿燒傷動物模型,結(jié)果證明FA可以有效治療角膜堿燒傷誘發(fā)的新生血管。

FA是植物界普遍存在的一種酚酸, 在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在, 主要以低聚糖多胺、脂類和多糖形式存在, 是當(dāng)歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一。最近有研究表明［3,4］, FA能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng), 小膠質(zhì)細(xì)胞是存在神經(jīng)系統(tǒng)免疫細(xì)胞, 與單核/巨噬細(xì)胞功能相似,包括單核/巨噬細(xì)胞在內(nèi)的炎癥組織細(xì)胞能分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等血管生成因子促進(jìn)新生血管的形成［5］。本研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用FA后, 角膜組織中浸潤的單核/巨噬等炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少, 提示局部組織內(nèi)的炎癥受到抑制。

IL-6在許多研究中被證實(shí)具有直接促進(jìn)新生血管的作用, Yao等［6］研究發(fā)現(xiàn)IL-6可以通過ERK1/2信號通路誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF、MMP-9等物質(zhì)促進(jìn)新生血管。還有研究［7］證實(shí)IL-6誘導(dǎo)的新生血管有缺陷, 缺乏周細(xì)胞覆蓋導(dǎo)致滲透性明顯增加。CCL2除了可以趨化炎癥細(xì)胞促進(jìn)新生血管之外, 也可通過促進(jìn)組織MMP-2、MMP-9的表達(dá)發(fā)揮作用［8］。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是一組降解細(xì)胞外基質(zhì)的依賴鈣(Ca)和鋅(Zn)離子蛋白水解酶, 具有修復(fù)損傷、血管再生、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等作用。其中MMP-9為機(jī)體中主要的Ⅳ型膠原酶, 在許多腫瘤組織中表達(dá)升高并促進(jìn)新生血管生成［9］, 角膜組織內(nèi)植入活化的巨噬細(xì)胞, 細(xì)胞分泌的MMP-9及VEGF會誘導(dǎo)角膜新生血管的生成［10］。

綜上所述, 本研究表明FA可以通過抑制炎癥細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞的浸潤, 抑制角膜組織中促炎、促血管的細(xì)胞因子表達(dá), 發(fā)揮抑制新生血管的作用, 為堿燒傷角膜新生血管的治療策略提供了有益參考。