殷雪艷　楊柳

摘 要：以ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1為材料，采用生物數(shù)據(jù)分析工具對(duì)煙草的半胱氨酸蛋白酶的基因和蛋白序列進(jìn)行分析，分別以GSDS、MEME和SignalP 4.1工具對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、保守基序和信號(hào)肽進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，NtCP-1和NtCP-2基因具有7個(gè)外顯子， NtCP-3和NtCP-4基因含有4個(gè)外顯子，NtCP-5基因具有3個(gè)外顯子，NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5基因具有上游序列，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-4和NtCP-5基因具有下游序列；檢測NtCP共有5個(gè)Motif，其核心保守基序區(qū)為Motif-1—Motif-2—Motif-4，且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中，Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸和谷氨酰胺；NtCP均屬于信號(hào)肽，NtCP-1和NtCP-2的信號(hào)區(qū)分布相同（1 ～ 22），NtCP-3和NtCP-4的信號(hào)區(qū)分布相同（1 ～ 20），NtCP-5的信號(hào)區(qū)為1 ～ 29。

關(guān)鍵詞：煙草； 半胱氨酸蛋白酶；基因序列；蛋白序列

中圖分類號(hào)：S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.09.001

Gene and Protein Sequence Analysis of Cysteine Protease in Tobacco

YIN Xueyan， YANG Liu， LUO Wanlin， ZHAO Shuang， LIU Biao， WANG Guangyun

（Liangshan Tobacco Company， Xichang，Sichuan 615000，China）

Abstract：ABW71226.1， BAA96501.1， ACB70409.1， AAW78660.1 and ADV41672.1 were as experimental materials， the tobacco cysteine protease genes and protein sequences were analyzed using biological data analysis tools including GSDS， MEME and SignalP 4.1. The results showed that NtCP-1 and NtCP-2 genes had 7 exons， NtCP-3 and NtCP-4 genes contained 4 exons， NtCP-5 gene had 3 exons， NtCP-1， NtCP-2 and NtCP-5 genes had the upstream sequence， NtCP-1， NtCP-2， NtCP-4 and NtCP-5 genes with the downstream sequence. 5 motifs were detected in NtCP， in which the core conserved motif region was Motif-1-Motif-2-Motif-4， and located in cysteine protease domain of the papain family， Motif-1 and Motif-2 contained cysteamine acid and glutamine. NtCP belonged to the signal peptide， the signal area of NtCP-1 and NtCP-2 were the same （1～22）； the signal regions of NtCP-3 and NtCP-4 were identical （1-20）， and the signal region of NtCP-5 was 1 ～ 29.

Key words： tobacco； cysteine protease； gene sequence； protein sequence

半胱氨酸蛋白酶是一種多功能的水解類蛋白酶，增加植物體抗性[1-4]，參與細(xì)胞衰老和死亡[5-6]，調(diào)節(jié)蛋白含量[7-8]；半胱氨酸蛋白酶的催化位點(diǎn)主要包括半胱氨酸和谷氨酰胺[9-10]；煙葉在烘烤期間，即變黃和定色期階段，促使煙葉變黃和大分子物質(zhì)充分降解[11]，而該生理反應(yīng)，均受到水分含量的影響，一定程度的水分脅迫，有利于縮短煙葉變黃時(shí)間，且促進(jìn)大分子物質(zhì)降解[12-13]。然而，半胱氨酸蛋白酶參與植物在水分脅迫時(shí)的生理反應(yīng)，降解受損的蛋白[14]，即半胱氨酸蛋白酶可能參與煙葉在烘烤期間的生化反應(yīng)。目前，關(guān)于深入研究半胱氨酸蛋白酶特性，主要采用生物信息學(xué)的方式進(jìn)行分析，如輻射松、西瓜、水稻等[15-17]，而煙草主要從其蛋白序列的方面進(jìn)行分析[18-19]，較為單一，為此筆者從半胱氨酸的基因和蛋白序列進(jìn)行分析，為煙葉半胱氨酸蛋白酶的特性研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 篩選煙草半胱氨酸蛋白酶家族成員

運(yùn)用NCBI[20]數(shù)據(jù)庫，檢索并提取煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列，其登錄號(hào)分別為ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1

和ADV41672.1，并分別對(duì)其進(jìn)行命名NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5[21]。

1.2 試驗(yàn)方法

采用GSDS繪圖工具[22]，依據(jù)堿基互補(bǔ)關(guān)系，構(gòu)建煙草半胱氨酸蛋白酶的基因結(jié)構(gòu)（外顯子、內(nèi)含子、上游和下游）；為了比較分析NtCP蛋白的序列特征，采用MEME工具[23]進(jìn)行分析，其序列長為6～50個(gè)氨基酸，E期望值（E-value）設(shè)定為10；使用SignalP 4.1工具[24]，分析NtCP的信號(hào)肽，其D-cutoff值以Matthews的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草半胱氨酸蛋白酶的基因結(jié)構(gòu)分析

通過分析NtCP的DNA序列和cDNA序列得出其基因結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖1所示。NtCP的同源基因有不同的基因結(jié)構(gòu)組成，基因的長度大約在1.5 kb至3.6 kb之間，NtCP基因序列的長度與外顯子/內(nèi)含子的數(shù)目沒有直接相關(guān)關(guān)系，根據(jù)NtCP的基因結(jié)構(gòu)，可以將其特征歸為三大類：第1類基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，含有7個(gè)外顯子，且均具有上下游序列，其成員主要為NtCP-1和NtCP-2；第2類基因含有4個(gè)外顯子，主要成員為NtCP-3和NtCP-4，但NtCP-3無上下游序列，而NtCP-4僅含有下游序列；第3類基因的結(jié)構(gòu)較為簡單，其外顯子數(shù)為3個(gè)，且具有上下游序列，該成員為NtCP-5。NtCP基因的結(jié)構(gòu)長度有很大的區(qū)別，而且在不同的基因之間，外顯子的長度不一樣，即使是同一個(gè)基因，其所包含的外顯子長度也存在差異，NtCP-1和NtCP-2的DNA序列較大，外顯子分布較為分散，即翻譯時(shí)間相對(duì)較長，而NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5的序列較小，且外顯子分布較為集中，有利于快速翻譯。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶的保守基序分析

通過對(duì)NtCP各成員蛋白的保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。在NtCP中檢測到4個(gè)保守基序，將其分別命名為Motif-1～4，主要的保守基序區(qū)有3個(gè)，它們的排列順序相對(duì)穩(wěn)定，該保守基序的排列順序?yàn)镸otif-1—Motif-2—Motif-4，核心保守基序區(qū)（Motif-1—Motif-2—Motif-4）在5個(gè)NtCP蛋白中都有存在，且NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均含有Motif-3（NtCP-5除外），表明序列的保守性存在特異性；根據(jù)煙草半胱氨酸蛋白酶保守基序的分布，保守基序的核心區(qū)都集中在蛋白質(zhì)的中間區(qū)域和C-端，而NtCP序列中所含有的木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域存在的位置與核心保守基序相同，推斷NtCP的核心保守基序是Pept_C1；在NtCP序列中，僅Motif-1和Motif-2含有半胱氨酸（C）和谷氨酰胺（Q）。2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶的信號(hào)肽分析

從信號(hào)肽、原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)3個(gè)方面對(duì)煙草半胱氨酸蛋白酶的信號(hào)肽進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖3），NtCP-1和NtCP-2在第13位丙氨酸的信號(hào)肽值（S）達(dá)到最大，分別為0.992和0.990，而原始的剪切位點(diǎn)（C）和綜合的剪切位點(diǎn)（Y）的最大分值均處于第23位甘氨酰胺，NtCP-1的值分別為0.609和0.758，NtCP-2的值為0.742和0.835，因此NtCP-1和NtCP-2均具有信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)處于第22與23位氨基酸之間，信號(hào)肽處于第1 ～ 22位的氨基酸，該信號(hào)肽的均值分別為0.943和0.939；NtCP-3和NtCP-4的信號(hào)肽值于第12位丙氨酸處達(dá)到最大，分別為0.983和0.974，原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第21位苯丙氨酸，NtCP-3的值分別為0.868和0.892，NtCP-4的值為0.807和0.848，即NtCP-3和NtCP-4具有信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)處于第20與21位氨基酸之間，信號(hào)肽處于第1 ～ 20位的氨基酸，該信號(hào)肽的均值分別為0.912和0.887；NtCP-5的信號(hào)肽值于第7位絲氨酸處達(dá)到最大（0.958），原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第30位精氨酸，其值分別為0.582和0.691，表明NtCP-5具有信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)處于第29與30位氨基酸之間， 且信號(hào)肽處于第1 ～ 29位的氨基酸，該信號(hào)肽的均值為0.844。

3 結(jié)論與討論

通過基因結(jié)構(gòu)分析，NtCP各成員具有的內(nèi)含子、外顯子之間存在差異，主要存在三種類型，N-端和C-端的基因結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，而中間區(qū)域差異較大，進(jìn)而為煙葉半胱氨酸蛋白酶的功能多樣性創(chuàng)造條件；NtCP具有核心保守基序區(qū)（Motif-1—Motif-2—Motif-4），Motif-1和Motif-2均含有半胱氨酸和谷氨酰胺，而半胱氨酸和谷氨酰胺為半胱氨酸蛋白酶的催化位點(diǎn)，可推斷NtCP催化位點(diǎn)為序列中間，且位于木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域中，即使未與底物結(jié)合，仍可保持電離狀態(tài)，且可能屬于papain家族[9-10]；NtCP均含有信號(hào)肽，可分泌于特定區(qū)域，確保煙草半胱氨酸蛋白酶的功能多樣性[25]。

參考文獻(xiàn)：

[1]ROJO E， MART I N R， CARTER C， et al. VPEgamma exhibits a caspase-like activity that contributes to defense against pathogens.[J]. Current biology Cb， 2004， 14（21）：1897.

[2]SIMOVASTOILOVA L， VASEVA I， GRIGOROVA B， et al. Proteolytic activity and cysteine protease expression in wheat leaves under severe soil drought and recovery.[J]. Plant physiol biochem， 2010， 48：200-206.

[3]HAO L， HSIANG T， GOODWIN P H. Role of two cysteine proteinases in the susceptible response of Nicotiana benthamiana to Colletotrichum destructivum and the hypersensitive response to Pseudomonas Syringae pv. tomato[J]. Plant science， 2006， 170（5）：1001-1009.

[4]MACIEL F M， SALLES C M C， RETAMAL C A， et al. Identification and partial characterization of two cysteine proteases from castor bean leaves （ Ricinus communis， L.） activated by wounding and methyl jasmonate stress[J]. Acta physiologiae plantarum， 2011， 33（5）：1867-1875.

[5]BHALERAO R， KESKITALO J， STERKY F， et al. Gene expression in autumn leaves[J]. Plant physiology， 2003， 131（2）：430-42.

[6]KUSAKA K， TADA Y， SHIGEMI T， et al. Coordinate involvement of cysteine protease and nuclease in the executive phase of plant apoptosis.[J]. Febs letters， 2004， 578（3）：363-367.

[7]JONES J T， MULLET J E. A salt- and dehydration-inducible pea gene， Cyp15a， encodes a cell-wall protein with sequence similarity to cysteine proteases[J]. Plant molecular biology， 1995， 28（6）：1055-1065.

[8]GRUDKOWSKA M， ZAGDAN SKA B. Multifunctional role of plant cysteine proteinases[J]. Acta biochimica polonica， 2004， 51（3）：609-624.

[9]WIEDERANDERS B. Structure-function relationships in class CA1 cysteine peptidase propeptides[J]. Acta biochimica polonica， 2003， 50（3）：691-713.

[10]BEERS E P， WOFFENDEN B J， ZHAO C. Plant proteolytic enzymes： possible roles during programmed cell death[J]. Plant molecular biology， 2000， 44（3）：399-415.

[11]宮長榮. 煙草調(diào)制學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2011：207-232.

[12]魏碩，蘇家恩，范志勇，等.變黃前期失水脅迫對(duì)煙葉烘烤特性的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，48（2）：309-313.

[13]魏碩，黃克久，汪代斌，等.變黃期失水脅迫對(duì)烤煙上部葉生理和物理特性的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，43（6）：630-634.

[14]KHANNA-CHOPRA R， SRIVALLI B， AHLAWAT Y S. Drought induces many forms of cysteine proteases not observed during natural Senescence[J]. Biochemical & biophysical research communications， 1999， 255（2）：324-327.

[15]吳建忠.輻射松半胱氨酸蛋白酶OTUBAIN-like基因生物信息分析[J].西部林業(yè)科學(xué)，2015，44（5）：1-712.

[16]陽永學(xué)，程維舜，曾紅霞，等.西瓜半胱氨酸蛋白酶基因ClCP1克隆及其生物信息學(xué)分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（28）：11286-11288，11319.

[17]嚴(yán)秀蕊，張大生，梁婉琪，等.水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表達(dá)與純化[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2010，28（2）：140-146.

[18]楊柳，趙爽，殷雪艷，等.煙草半胱氨酸蛋白酶的特性和結(jié)構(gòu)分析[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，24（7）：1-4.

[19]馬世明，羅家佐，王德勛，等.煙草半胱氨酸蛋白酶的生物學(xué)分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（16）：17-19.

[20]GREENWOOD F C， HUNTER W M， GLOVWR J S. The Preparation of i-131-labelled human growth hormone of high specific radioactivity[J]. Biochemical journal， 1963， 89（1）：114.

[21]陳二龍，蘇家恩，范志勇，等.Bright Yellow 2烤煙熱激蛋白90生物信息學(xué)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，48（10）：1734-1740.

[22]FRECH C， CHOO C， CHEN N. FeatureStack： Perl module for comparative visualization of gene features[J]. Bioinformatics， 2012， 28（23）：3137.

[23]Bailey T L， Elkan C. The value of prior knowledge in discovering motifs with MEME[J]. 1995（3）：21-29.

[24]XIAO C， SOMERVILLE C， ANDERSON C T. polygalacturonase involved in expansion 1 functions in cell elongation and flower development in Arabidopsis[J]. Plant cell， 2014， 26（3）：1018.

[25]閆龍鳳，楊青川，韓建國，等.植物半胱氨酸蛋白酶研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2005（5）：11-19.