董建成， 葛孝棟， 王清清， 魏取福

(生態(tài)紡織教育部重點實驗室(江南大學)， 江蘇 無錫 214122)

光動力抗菌化學療法(PACT)[1]是基于光動力療法(PDT)，通過光敏劑與細菌結合，在光照下產(chǎn)生活性氧簇(ROS)來滅活細菌。相比于傳統(tǒng)抗菌材料，如茶多酚[2]、殼聚糖[3]、重金屬銀[4]等，PACT法生物毒性低，在滅菌過程中不會使微生物產(chǎn)生耐藥性[5]，因而在抗菌材料領域具有廣泛的應用前景。

PACT常用的光敏劑有吩噻嗪類、酞菁類、卟啉類光敏劑等。原卟啉(PpIX)是一種卟啉類光敏劑，其前驅體5-氨基酮戊酸(5-ALA)是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準藥物。游離的PpIX具有高效光敏化能力，但其回收困難，重復利用性差[6-7]。此外，PpIX價格高昂，合成工藝復雜，從而對PpIX進行固定化使其具有可重復利用性變得尤為重要。目前，光敏劑PpIX在多壁碳納米管[8-9]、多孔硅膠[10]、金屬及其氧化物納米顆粒[11-12]、殼聚糖[13-14]等方面的負載已被廣泛研究，但已有文獻對PpIX在纖維素基材類的負載，并用于光動力抗菌方面的研究不多。相比于其他材料，纖維素類基材如細菌纖維素、棉等具有天然可降解性、生物相容性和可再生性。

本文利用細菌纖維素(BC)作為PpIX固定載體，首先利用不同濃度的NaIO4氧化細菌纖維素，然后采用還原胺化反應引入乙二胺來鍵接PpIX，最后評價了負載PpIX后的細菌纖維素對金黃色葡萄球菌的光敏抗菌效果及可重復利用性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料與儀器

細菌纖維素(由木醋桿菌發(fā)酵制得)，氫氧化鈉、高碘酸鈉、乙二胺、乙二醇、二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、乙酸、鹽酸羥胺、百里香酚藍，分析純，國藥集團上?；瘜W試劑公司；氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)、N，N′-羰基二咪唑(CDI)、原卟啉，分析純，上海維塔試劑有限公司；金黃色葡萄球菌(ATCC-6538)，上海協(xié)久生物科技有限公司。

LABCONCO型凍干機(美國LABCONCO有限公司)； Nicolet iS 10 型傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR，中國賽默飛世爾科技有限公司)；Renishaw RM1000型拉曼光譜儀(英國雷尼紹公司)；Rigaku-D/Max-2500 型X射線衍射儀(XRD，日本理學公司)；TA Q200型熱失重儀(TG,美國TA公司)；SUL 510型掃描電子顯微鏡(SEM，日本日立株式會社)；XQ500 W型氙燈(上海藍晟電子有限公司)；SW-CJ-ID型單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；GR60DA型高壓滅菌鍋(南京康辰科學儀器有限公司)； BSP-150型生化培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)。

1.2 細菌纖維素的預處理

將發(fā)酵培養(yǎng)15 d的細菌纖維素(BC)取出，浸沒在質量分數(shù)為4%的NaOH溶液中，于80 ℃的水浴鍋中堿煮12 h后取出，然后更換NaOH溶液繼續(xù)堿煮12 h。最后用去離子水反復沖洗、浸泡堿煮后的細菌纖維素，用pH試紙測試其表面酸堿性，直至pH試紙不變藍。

1.3 氧化細菌纖維素的制備

首先將燒杯中的高碘酸鈉(NaIO4)溶液在恒溫搖床中加熱至37 ℃，然后把直徑、厚度相近的細菌纖維素分3組分別放入NaIO4溶液中，對應的NaIO4溶液濃度分別為0.2、0.3、0.4 mol/L。NaIO4溶液與細菌纖維素的用量為V(NaIO4)∶m(BC)=20∶1。將上述反應體系放入到恒溫搖床中，于37 ℃反應4 h，然后加入乙二醇(體積為體系體積的1/5)中繼續(xù)反應4 h。取出反應后的氧化細菌纖維素(BC-CHO)，用去離子水反復沖洗、浸泡，直至用淀粉-KI試紙在BC-CHO表面測試不變黑。最后將BC-CHO放入-40 ℃冰箱預冷凍12 h后，用凍干機在5 Pa條件下干燥12 h得到BC-CHO冷凍干燥膜。

1.4 乙二胺化細菌纖維素的制備

稱取3.00 g乙二胺放入燒杯中，加入100 mL DMSO溶解，然后在燒杯中加入乙酸調節(jié)體系pH值至6.0，將燒杯放入恒溫搖床中，使體系溫度上升至37 ℃，然后在體系中加入300 mg所制備的BC-CHO納米纖維膜，用鋁箔包覆燒杯避光，調節(jié)搖床速度為100 r/min，反應12 h。取出細菌纖維素膜，用20 mL DMSO清洗3次。

稱取3.77 g氰基硼氫化鈉放入燒杯中，加入100 mL DMSO溶解，將上述洗滌后的細菌纖維素膜放入燒杯中，然后放入37 ℃恒溫搖床(搖床速度為100 r/min)中反應24 h，得到乙二胺化細菌纖維素(BC-EDA)，將BC-EDA取出后先用20 mL DMSO清洗3 次，再用30 mL去離子水清洗3 次。將洗滌后的BC-EDA放入-40 ℃冰箱預冷凍12 h，用凍干機在5 Pa條件下干燥12 h得到BC-EDA冷凍干燥膜。

1.5 原卟啉接枝氨基化細菌纖維素的制備

稱取282 mg原卟啉(PpIX)和81 mg N,N′-羰基二咪唑，溶解在75 mL 的DMSO中，然后在40 ℃搖床中活化4 h，搖床速度為120 r/min。在上述體系中加入BC-EDA凍干膜，繼續(xù)反應24 h，反應結束后先用DMSO清洗(20 mL，3次)，再用去離子水清洗(30 mL，3次)。然后于40 ℃真空干燥5 h，得到原卟啉接枝氨基化細菌纖維素膜(BC-EDA-PpIX)。BC-EDA-PpIX接枝的化學反應流程如圖1所示。

圖1 細菌纖維素-原卟啉(BC-EDA-PpIX)接枝化學反應流程Fig.1 Chemical reaction process of grafting PpIX on bacterial cellulose via ethylenediamine

1.6 測試與表征

1.6.1醛基含量測定

在250 mL錐形瓶中加入50 mL質量濃度為20 g/L的鹽酸羥胺/甲醇溶液和8滴百里香酚藍指示劑，用氫氧化鈉/甲醇標準液滴定至溶液為黃色，不計消耗氫氧化鈉溶液的體積[15]。然后向錐形瓶中加入剪碎的BC-CHO樣品，40 ℃條件下充分反應3 h后，用0.03 mol/L的氫氧化鈉/甲醇溶液滴定至黃色，且在30 s內保持不褪色。醛基含量計算公式為

C=0.03V/m

式中：C為BC-CHO中的醛基含量， mmol/g；V為滴定時消耗的氫氧化鈉/甲醇溶液的體積， mL；m為BC-CHO的質量，g。

1.6.2表面形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察纖維膜的表面形貌和結構。樣品在掃描前需經(jīng)過噴金處理，以便降低其表面放電效應。

1.6.3化學結構測試

采用傅里葉變換紅外光譜儀對接枝反應前后的BC膜樣品進行測試，利用衰減全反射紅外光譜法(ATR-FT-IR)進行分析。分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16，波數(shù)范圍為4 000～800 cm-1。

1.6.4拉曼光譜測試

采用拉曼光譜儀對PpIX(粉末)、BC-EDA膜、BC-EDA-PpIX膜進行測試，樣品在514 nm激發(fā)獲得拉曼光譜。

1.6.5熱穩(wěn)定性測試

利用熱失重分析儀對材料的熱穩(wěn)定性進行測試。測試范圍為20～600 ℃，升溫速率為10 ℃/min，在N2保護下進行。

1.6.6晶體結構測試

采用X射線衍射儀對試樣的晶體結構進行分析。實驗條件為：Cu靶，加速電壓40 kV，電流強度200 mA，掃描速度4(°)/min，掃描范圍5°～40°。

1.6.7光動力抗菌評價

參照AATCC 100—2012《抗菌紡織品的評價方法》對BC-EDA-PpIX纖維膜光敏抗菌性能進行評價。

將干燥的空白纖維膜和BC-EDA-PpIX纖維膜分別作為空白對照樣和實驗樣。在各樣品上剪取若干形狀厚度均一的圓形試樣，平鋪于24孔板內。取0.1 mL濃度為1×108～3×108CFU/mL的菌液接種在各試樣上。每個樣品均分為2組，分別置于光照及暗室的環(huán)境下培養(yǎng)30 min，隨后將原菌液及試樣上的菌液在離心管中依次等梯度稀釋106倍，制作出10倍稀釋系列。分別從稀釋系列的各離心管中取10 μL溶液注入含瓊脂培養(yǎng)基的平皿內，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。最后測其菌落數(shù)，計算出抑菌率r，對抗菌效果進行評價。

式中：N0、Ni分別為平板上原樣生長細菌的數(shù)和樣品抗菌后所剩余的菌落數(shù)。

用質量分數(shù)為75%的酒精洗滌上述BC-EDA-PpIX纖維膜2次，干燥后再按上述方法進行抗菌評價；然后繼續(xù)用酒精洗滌2次，干燥后進行抗菌評價，測試其抗菌持久性。

2 結果與討論

2.1 BC-CHO纖維膜的結構與性能分析

2.1.1醛基含量分析

通過鹽酸羥胺法測定BC-CHO中醛基的含量。當NaIO4濃度分別為0.2、0.3、0.4 mol/L時，測得對應的二醛細菌纖維素醛基含量分別為2.13、3.42、3.76 mmol/g。NaIO4可特異性地氧化纖維素葡萄糖環(huán)上2、3號位上的羥基生成二醛細菌纖維素BC-CHO。采用高濃度的NaIO4，在氧化過程中細菌纖維素內部氫鍵會被嚴重破壞，細菌纖維素尺寸劇烈收縮，力學性能銳減，影響其應用[16-17]；因此，選擇NaIO4濃度為0.3 mol/L所制備的BC-CHO進行后續(xù)卟啉接枝反應，其氧化程度適當，纖維膜尺寸變化不大。

2.1.2BC-CHO纖維膜的化學結構分析

圖2 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of fiber membranes oxidized at different NaIO4 concentrations

2.1.3BC-CHO纖維膜的晶體結構分析

圖3為BC及不同氧化程度BC-CHO的XRD譜圖。細菌纖維素是高結晶度的I型纖維素，其結晶度可達60%～70%，圖中衍射角2θ為14.4°、16.7°、22.6°處為I型纖維素的特征衍射峰[15]。BC經(jīng)過NaIO4選擇性氧化后，BC-CHO部分保留了初始BC的I型纖維素特征峰，同時BC-CHO逐步在2θ為12.6°、20.5°、21.7°處出現(xiàn)衍射峰，并伴隨著I型纖維素特征峰的降低，這表明初始BC在被NaIO4氧化過程中發(fā)生部分晶型轉變(II型纖維素)。由于NaIO4選擇性氧化造成了纖維素葡萄糖吡喃環(huán)的開環(huán)，使得部分鏈節(jié)被破壞，使得原有的結晶規(guī)整度降低，從而在XRD譜圖中顯示了較多位于主要衍射峰之間的雜散峰，其中18°～20°處的是非晶纖維素的衍射峰[[21]。

圖3 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜X射線衍射譜圖Fig.3 XRD spectra of fiber membranes oxidized by NaIO4at different concentrations

2.1.4BC-CHO纖維膜的熱穩(wěn)定性分析

圖4示出BC、BC-CHO纖維膜的TG和DTG曲線。BC的化學改性會顯著改變纖維膜的熱分解行為，如熱分解溫度降低、殘?zhí)柯侍岣叩萚22]。從圖4可看出，氧化后的細菌纖維素膜熱分解行為發(fā)生了明顯的變化。在N2氛圍中，BC在280 ℃開始分解，在300～340 ℃時質量損失速率增大，纖維素在分解時，先得到左旋葡萄糖，然后進一步分解為CO、CO2等小分子[23]。BC-CHO分3步降解：第1步，100 ℃左右時的質量損失為葡萄糖吡喃環(huán)上醛基形成的水合醛和半縮醛受熱脫水造成的；第2步在220～250 ℃脫水；第3步在280～300 ℃降解。所有BC-CHO的熱分解溫度都低于BC，且隨氧化程度的提高逐漸降低。

圖4 不同NaIO4濃度氧化的纖維膜熱穩(wěn)定性曲線Fig.4 TG(a) and DTG (b) curves of fiber membranes oxidized by different concentrations NaIO4

2.2 BC-EDA纖維膜的化學結構分析

圖5為BC、BC-CHO、BC-EDA纖維膜的紅外光譜圖。可以看出：接枝乙二胺后的氧化細菌纖維素在1 730、880 cm-1處的醛基特征峰消失；在1 560 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，為BC-EDA上N—H的彎曲振動峰[24]。醛基特征峰的完全消失和新吸收峰的出現(xiàn)，表明BC-CHO上的醛基完全被乙二胺取代。

圖5 納米纖維膜的紅外光譜圖Fig.5 FT-IR spectra of naofibrous membranes

2.3 BC-EDA-PpIX纖維膜的性能分析

2.3.1PpIX接枝前后細菌纖維素膜的形貌結構

圖6示出初始細菌纖維素BC和原卟啉接枝后BC-EDA-PpIX的表面形貌?？梢钥闯?，BC在進行化學改性前，表面纖維集束包覆成連續(xù)相，形成對內層纖維的遮掩。經(jīng)過氧化、PpIX接枝后，BC表面集束的連續(xù)相消失，顯露出內層纖維，BC-EDA-PpIX內層纖維的高比面積更有利于卟啉與底物的接觸，從而有效發(fā)揮負載卟啉的光敏化能力。

圖6 BC和BC-EDA-PpIX纖維膜的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6 SEM images of BC and BC-EDA-PpIX fibrous membranes

2.3.2BC-EDA-PpIX的拉曼光譜

圖7為PpIX、BC-EDA、BC-EDA-PpIX的拉曼光譜圖。由于PpIX具有對稱結構，所以采用拉曼光譜儀來表征PpIX固定化后的化學結構。

圖7 PpIX粉末、BC-EDA-PpIX纖維膜、BC-EDA纖維膜的拉曼光譜圖Fig.7 Raman spectra of pure PpIX powder, BC-EDA-PpIX and BC-EDA fibrous membrane

2.3.3BC-EDA-PpIX纖維膜的抗菌性能

表1 BC-EDA-PpIX纖維膜對金黃色葡萄球菌的殺菌效果Tab.1 Antibacterial effect of BC-EDA-PpIX fibrous membrane against Staphylococcus aureus

BC-EDA-PpIX經(jīng)過酒精洗滌后光敏抗菌效果雖有所降低，但經(jīng)過5次洗滌后抑菌率仍達到56.61%。細菌纖維素的直徑在納米級別，納米尺寸的結構容易受到外界因素的影響，而PpIX共價結合在細菌纖維素膜表面，洗滌過程中可能會使部分光敏劑脫落，造成抗菌效果下降。在今后的研究工作中將會采用大直徑纖維素制品如棉織物、麻織物等作為光敏劑載體進行共價負載，制備光敏抗菌織物，以實現(xiàn)長效的光敏抗菌效果。

3 結 論

1)通過改變NaIO4濃度制備出不同醛基含量的氧化細菌纖維素膜(BC-CHO)，其醛基含量越高，BC-CHO的熱分解溫度越低，結晶性越低。適當氧化的細菌纖維素在保持良好形貌結構的同時具有較高的醛基含量。

2)原卟啉接枝氨基化細菌纖維素膜(BC-EDA-PpIX)具有良好的光敏抗菌效果，首次光動力抗菌，金黃色葡萄球菌的殺菌率超過98%以上，經(jīng)過5次酒精洗滌后仍具有良好的抑菌效果。

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