徐宏蕾， 王亞珍， 謝 晶， 李 立， 薛 斌， 邵則淮， 華欣怡， 孫 濤

（上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306）

牛肉在加工和儲(chǔ)存的過程中，很容易受到微生物的污染，從而發(fā)生腐敗變質(zhì)。另外，牛肉中含的脂肪在自然光照和室溫下可以發(fā)生自動(dòng)氧化[1-2]，進(jìn)而造成過氧化值升高，從而影響牛肉的風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。目前冷卻肉的保鮮技術(shù)主要有冷凍保鮮、輻射保鮮、氣調(diào)保鮮、高壓保鮮、真空包裝保鮮、化學(xué)防腐劑保鮮和涂膜保鮮等[3]，而大部分的化學(xué)防腐劑對(duì)人類健康都存在一定的危害，因此天然保鮮劑有著廣泛的前景[4-5]。將天然保鮮劑加入包裝膜中，可以進(jìn)一步提高對(duì)食品的保鮮效果[6]。

殼聚糖具有良好的成膜性、阻隔性、生物相容性及可生物降解等特點(diǎn)。單一的殼聚糖膜力學(xué)性能較差，因此將明膠與殼聚糖共混制膜以改善殼聚糖膜的力學(xué)性能[7]。殼寡糖是殼聚糖降解后的產(chǎn)物，具有良好的抗氧化性能及抑菌活性，并且與殼聚糖具有相同的結(jié)構(gòu)單元，兩者具有良好的相容性。作者將殼聚糖、明膠及殼寡糖共混制得復(fù)合膜，研究了殼寡糖對(duì)殼聚糖—明膠復(fù)合膜性能的影響，以期制備一種具有良好保鮮效果的復(fù)合膜。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉：購自上海市牛羊肉公司；殼聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量10萬，脫乙酰度90%）：浙江金殼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；明膠（食品級(jí)）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；殼寡糖（相對(duì)分子質(zhì)量1 000，脫乙酰度90%）：浙江金殼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；綠茶多酚（兒茶素質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.20%）：湖州榮凱植物提取有限公司提供；Nisin（乳酸鏈球菌素/乳酸鏈球菌肽）：浙江新銀象生物工程有限公司提供；胰蛋白胨大豆肉湯：北京路橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；大腸桿菌（Escherichia coli）、 金色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）：上海海洋大學(xué)食品學(xué)院提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DCP-KZ300型電腦測(cè)控抗張?jiān)囼?yàn)機(jī)：四川長(zhǎng)江造紙儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀：天津港東科技發(fā)展股份有限公司產(chǎn)品；HHS型電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；KQ-600KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；PYXDHS-40X50BS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SW-CJ-1F型凈化工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；UV-2000型紫外分光光度計(jì)：上海龍尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；AG8953電子分析天平：瑞士PRECISA公司產(chǎn)品；DELTA-320-S型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司產(chǎn)品；FOSS Kjehec 2300全自動(dòng)定氮儀：瑞士福斯公司產(chǎn)品。

1.3 殼聚糖基復(fù)合膜的制備

將殼聚糖—醋酸溶液與明膠溶液按體積比2∶1混合，加入體積分?jǐn)?shù)1%甘油，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的殼寡糖，磁力攪拌至完全溶解。靜置消泡后，取75 mL膜液均勻鋪展于干燥潔凈的有機(jī)玻璃板（20 cm×30 cm）上，自然干燥后揭膜，保存于相對(duì)濕度（RH）為53%（用飽和硝酸鎂溶液保持）的干燥器內(nèi)備用。

1.4 膜的性能測(cè)定

1.4.1 厚度及透光率 用數(shù)顯卡尺在待測(cè)膜的4個(gè)角以及中心位置取5點(diǎn)測(cè)其厚度，得到的平均值計(jì)為膜的厚度。選取光滑、平整、潔凈且無瑕疵的膜，將待測(cè)膜剪成3 cm×1 cm大小，緊貼在比色皿（1 cm）的一側(cè)，置于紫外可見分光光度計(jì)的樣品池中，以空皿做空白對(duì)照，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)其透光率，用透光率的大小間接表示膜的透明度。透光率越大，膜的透明度越好。

1.4.2 機(jī)械性能 膜的機(jī)械性能參照GB13022-91[8]。試驗(yàn)條件：拉伸速度為150 mm/min，夾具間距50 mm，測(cè)試環(huán)境溫度為（23±1）℃，濕度為50%。每組膜測(cè)定6次。

1.4.3 水蒸氣透過系數(shù)及水溶性 水蒸氣透過系數(shù)的測(cè)定參照GB1037-70[9]。將膜裁成40 mm×40 mm的正方形，在干燥器中干燥至恒重后稱重（m1），然后放入 300 mL蒸餾水中，于室溫25℃下溶解12 h，再將膜在60℃的條件下干燥至恒重，稱重（m2），根據(jù)膜質(zhì)量變化計(jì)算水溶性。

水溶性（%）=（（m1－m2）/m1）×100%。

1.4.4 抑菌性能 復(fù)合膜的抑菌作用通過抑菌圈法測(cè)定[10]。無菌濾紙片為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3個(gè)平行樣品的平均值。

1.4.5 抗氧化性能 復(fù)合膜抗氧化性能的測(cè)定參照文獻(xiàn)[11]。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)最少重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件處理，得到的結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，并使用Origin8.5軟件進(jìn)行作圖。

1.5 牛肉的保鮮研究

1.5.1 樣品處理 所用刀具和案板用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇溶液棉球擦拭并在紫外燈下照射30 min進(jìn)行殺菌消毒。新鮮牛肉在無菌環(huán)境下進(jìn)行操作，去除筋膜及多余脂肪，切成150 g左右大小均勻的肉塊，隨機(jī)分組，裝于聚苯乙烯塑料托盤內(nèi)，表面分別用殼聚糖/明膠復(fù)合膜、殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜包裹，以未經(jīng)任何包裝的樣品作為空白對(duì)照。將所有樣品貯存在（4±1） ℃的冰箱中，分別在 0、2、4、6、8、10、12、14 d 進(jìn)行各理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)樣品每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

1.5.2 pH值的測(cè)定 參照 GB/9695.5-2008[12]。將牛肉樣品的包裝打開后，立即稱取5.00 g肉樣，剁碎后加入45 mL蒸餾水于燒杯中，均勻攪拌后靜置30 min，然后進(jìn)行過濾，用精密數(shù)顯pH計(jì)測(cè)定各樣品濾液的pH值[13]。

1.5.3 揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定 參照GB/T5009.44-2003。應(yīng)用半微量凱氏定氮的原理，采用Kiehec2300型全自動(dòng)定氮儀測(cè)定各樣品儲(chǔ)存期間揮發(fā)性鹽基氮的含量[14]。

1.5.4 硫代巴比妥酸值（TBARS值）的測(cè)定 將樣品牛肉切碎，準(zhǔn)確稱取5.00 g置于潔凈的燒杯中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液和4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15%BHT溶液，混合后置于離心管中，10 000 r/min，4℃條件下均質(zhì)1 min后進(jìn)行5 min高速離心，取上清液于50 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸溶液定容。取2 mL溶液，加入2 mL 20 mmol/L硫代巴比妥酸溶液，（94±1）℃條件下水浴35 min，冷卻后用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)532 nm處測(cè)定其吸光值。采用2 mL蒸餾水與2 mL硫代巴比妥酸溶液的混合液按上述步驟測(cè)定作為空白對(duì)照。TBA質(zhì)量分?jǐn)?shù)以1 kg樣品牛肉中含有的丙二醛的毫克數(shù)表示[15]。

1.5.5 菌落總數(shù)的測(cè)定 參照GB478 9.2-2010[16]。具體方法如下：將準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，加入45 mL生理鹽水進(jìn)行均質(zhì)，制成樣品勻液，然后依次進(jìn)行10倍梯度稀釋。根據(jù)樣品的腐敗程度，選擇適宜的稀釋倍數(shù)。吸取100 μL適宜濃度的稀釋液加入到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌涂布棒涂布均勻。然后將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察記錄平板上的菌落數(shù)，結(jié)果以菌落總數(shù)的對(duì)數(shù)值 lg（CFU/g）表示。

1.5.6 感官評(píng)價(jià) 參照參考文獻(xiàn)。每次取1份樣品，由5人組成感官評(píng)定小組進(jìn)行品評(píng)，最終結(jié)果按“多數(shù)原則”確定。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用4段評(píng)分法，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[17]。

表1 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring criteria

2 結(jié)果與討論

2.1 物理性能

表2給出了殼聚糖—明膠復(fù)合膜（A）、殼聚糖-明膠-殼寡糖復(fù)合膜（B）的部分性能參數(shù)。從表中可以看出，添加殼寡糖后，復(fù)合膜的厚度增大、透光率降低、抗拉伸性能有所提升，斷裂伸長(zhǎng)率下降，殼聚糖和明膠具有良好的成膜性，而不易成膜的殼寡糖會(huì)導(dǎo)致復(fù)合膜變脆，使膜的斷裂伸長(zhǎng)率下降[12]。殼寡糖的加入使得復(fù)合膜的水蒸氣透過系數(shù)和水溶性上升，這可能是由于殼寡糖分子內(nèi)部含有較多親水基團(tuán)導(dǎo)致。

2.2 抗氧化性和抑菌性

抗氧化性和抑菌性是食品保鮮膜的重要性能之一，添加殼寡糖后復(fù)合膜的抗氧化及抑菌性能見表3。由表3可知，添加殼寡糖后，復(fù)合膜的抗氧化及抑菌性均有較大提升。DPPH自由基清除能力被認(rèn)為是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[18-19]。從表3中可知，未加殼寡糖的膜DPPH清除能力非常弱，加入殼寡糖后復(fù)合膜的DPPH自由基清除能力顯著提高。從表3中可知，殼寡糖的加入提高了復(fù)合膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，可以期望殼聚糖—明膠—?dú)す烟菑?fù)合膜比殼聚糖/明膠復(fù)合膜具有更好的保鮮性能。

表2 殼聚糖基復(fù)合膜的物理性能參數(shù)Table 2 Physical properties of chtiosan-based composite films

2.3 對(duì)牛肉的保鮮性能

2.3.1 牛肉pH值的變化 pH值是反映牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，它的變化直接影響著牛肉的顏色、嫩度、風(fēng)味、保質(zhì)期等。GB/T9695.5-2008《肉與肉制品pH值測(cè)定》給出的肉類等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：一級(jí)鮮肉5.8～6.2，二級(jí)鮮肉 6.3～6.6，6.7以上為變質(zhì)肉。 圖 1為殼聚糖/明膠復(fù)合膜（A）及殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜（B）在貯存過程中pH值的變化，從圖1可知，新鮮牛肉的初始pH值約為6.53，在0～4 d內(nèi)，兩組的pH值均出現(xiàn)下降的情況，且在第4 d都已達(dá)到最低點(diǎn)，這可能是由于包裝后的牛肉在低溫條件下繼續(xù)排酸成熟，引起pH值的下降。第4 d之后，兩組樣品的pH值都開始回升。隨著貯存期的延長(zhǎng)，牛肉中的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)分解酶及微生物的共同作用下開始分解，分解后產(chǎn)生了堿性物質(zhì)[20]，這可能是造成牛肉pH值增大的原因。從圖中可以看出，對(duì)照組即沒有任何包裝處理的牛肉pH值迅速上升，在第8天已達(dá)到二級(jí)鮮度的臨界值。而經(jīng)殼聚糖復(fù)合膜包裝后的牛肉pH值上升較為緩慢，其中殼聚糖/明膠/殼寡糖包裝的樣品在第14天時(shí)仍處于二級(jí)鮮度范圍內(nèi)。

2.3.2 牛肉TVB-N值的變化 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）指動(dòng)物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，是動(dòng)物性食品新鮮程度的重要指標(biāo)[21]。GB 2710-2003中給出的TVB-N鮮度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：一級(jí)鮮度≤15 mg/hg，二級(jí)鮮度≤20 mg/hg，變質(zhì)肉＞20 mg/hg。圖2為殼聚糖/明膠復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（A）、殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（B）和空白對(duì)照組（C）貯存過程中牛肉的TVB-N值變化，在冷藏前4天，兩組包裝膜內(nèi)牛肉樣品的TVB-N值相差不大，并且在前8天實(shí)驗(yàn)組的TVB-N值均保持在一級(jí)鮮度的范圍內(nèi)。然而空白對(duì)照組在第6天時(shí)已經(jīng)開始明顯高于實(shí)驗(yàn)組，后期TVB-N值上升速度加快。在貯藏第14天，B組的TVB-N值為18.37 mg/hg，低于A組和對(duì)照組，仍維持在二級(jí)鮮度范圍內(nèi)，說明殼寡糖加入對(duì)牛肉在貯藏期間TVB-N值的上升具有一定的抑制作用。

圖1 冷藏過程中牛肉的pH值變化Fig.1 pH values of beef during storage

圖2 冷藏過程中牛肉的TVB-N值變化Fig.2 TVB-N values of beef during storage

2.3.3 牛肉TBARS值的變化 牛肉中含有較高含量的不飽和脂肪酸，很容易被氧化，氧化后的分解產(chǎn)物丙二醛（MAD）可以和硫代巴比妥酸（TBA）發(fā)生反應(yīng)，得到的產(chǎn)物是一種穩(wěn)定的紅色復(fù)合物，可以采用紫外分光光度計(jì)對(duì)其含量進(jìn)行檢測(cè)，通過測(cè)定此復(fù)合物的含量可以評(píng)價(jià)肉類在儲(chǔ)藏過程中的品質(zhì)變化[22]。參考評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)TBARS處于0.202～0.664時(shí)為良質(zhì)肉；大于1時(shí)為次質(zhì)肉[23]。

如圖3所示，冷藏期間采用不同包裝膜包裝牛肉的TBARS值的變化與TVB-N值的變化趨勢(shì)相似，各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的TBARS值均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。從第4天開始，對(duì)照組的TBARS值迅速增大，貯藏第10天，TBARS值達(dá)到0.993 mg/kg，已接近變質(zhì)肉。A組（殼聚糖/明膠復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組）在第14天時(shí)已屬于變質(zhì)肉，B組 （殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組）在第 12天時(shí)，TBARS值開始超過良質(zhì)肉的范圍，且在貯藏期間，B組樣品TBARS值始終低于A組。說明殼寡糖對(duì)貯藏期間被包裝牛肉樣品的TBARS值的上升有一定的抑制作用，起到了抗氧化的作用，達(dá)到了保鮮的效果。

圖3 冷藏過程中牛肉的TBARS值變化Fig.3 TBARS values of beef during storage

2.3.4 牛肉菌落總數(shù)的變化 微生物數(shù)量的多少是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要依據(jù)，可以反映出食品的腐敗情況。GB4789.2-2010中給出的根據(jù)活菌總數(shù)評(píng)價(jià)肉的新鮮度的標(biāo)準(zhǔn)為：新鮮肉為5.0×104cfu/g 以下， 次鮮肉為 5.0×104～5.0×106cfu/g，變質(zhì)肉為5.0×106cfu/g以上。圖4為殼聚糖/明膠復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（A）、殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（B）和空白對(duì)照組（C）貯存過程中牛肉菌落總數(shù)變化。冷藏前4天，所有組樣品的細(xì)菌總數(shù)均維持在一級(jí)鮮度的范圍內(nèi)，隨后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的細(xì)菌總數(shù)隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢(shì)（p＜0.05）。其中C組的細(xì)菌總數(shù)上升速率最快，貯存至第12天時(shí)細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值已達(dá)到5.96，接近腐敗；第14天，A、B實(shí)驗(yàn)組的細(xì)菌總數(shù)的對(duì)數(shù)值接近6.0，盡管在1.2.5實(shí)驗(yàn)中殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，但是殼寡糖的加入并未明顯提高復(fù)合膜在牛肉保鮮中的抑菌性，這可能是由于除大腸桿菌及金黃色葡萄球菌外，生鮮肉中最常見的幾種引起肉腐敗變質(zhì)的腐敗菌還有假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌及熱殺索絲菌[24]。

圖4 冷藏過程中牛肉的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值變化Fig.4 Viable bacterial count of beef during storage

2.3.5 感官評(píng)價(jià) 表4為殼聚糖/明膠復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（A）、殼聚糖/明膠/殼寡糖復(fù)合膜實(shí)驗(yàn)組（B）和空白對(duì)照組（C）感官色澤評(píng)分隨時(shí)間的變化圖。從表中可見，各組的感官色澤評(píng)分均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，各組感官色澤評(píng)分值之間無顯著性差異（p＞0.05）。C組在實(shí)驗(yàn)第2天感官色澤開始劣變，A組（殼聚糖-明膠復(fù)合膜）和B組（殼聚糖-明膠-殼寡糖復(fù)合膜）的感官色澤劣變分別開始在第4天和第6天，相比于空白對(duì)照組分別延長(zhǎng)了2 d和4 d；在實(shí)驗(yàn)第14天，C組感官色澤評(píng)分下降明顯，達(dá)到1.41，A組評(píng)分高于C組，為2.47，而B組評(píng)分最高，為3.36。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種復(fù)合膜對(duì)牛肉顏色劣變均有延緩作用，且殼聚糖—明膠—?dú)す烟菑?fù)合膜效果優(yōu)于殼聚糖—明膠復(fù)合膜。

表4 不同復(fù)合膜包裝條件下感官顏色的變化Table 4 Changes of color in different conditions

3 結(jié)語

殼寡糖使殼聚糖—明膠復(fù)合膜的抗拉伸性能有所提升，但其他機(jī)械性能指標(biāo)有所下降；殼寡糖使復(fù)合膜的抗氧化性、抑菌性均有較大提升；添加殼寡糖后，殼聚糖/明膠復(fù)合膜對(duì)牛肉的保鮮性能有較大提升，可將貨架期延長(zhǎng)6 d；兩種復(fù)合膜對(duì)牛肉的感官色澤劣變均有延緩作用，且殼聚糖/明膠/殼 寡糖復(fù)合膜效果優(yōu)于殼聚糖—明膠復(fù)合膜。