孔 惠， 邢曉平， 曹玉華*， 曹光群

（1.江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；2.鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的蛋白質(zhì)[1-3]。明膠是以膠原蛋白為原料，通過不可逆轉(zhuǎn)的熱變性部分水解得到的一種可溶性蛋白質(zhì)[4]，相對(duì)分子質(zhì)量分布在幾萬至幾百萬之間，不能被人體直接吸收。膠原蛋白肽作為膠原蛋白或明膠的酶解產(chǎn)物，相對(duì)分子質(zhì)量低于10 000，具有特殊的生理活性，尤其以小分子的膠原蛋白肽更易被人體吸收。

市面上的膠原蛋白產(chǎn)品多從豬和牛的皮、骨中提取[5]。近年來海洋生物膠原蛋白的開發(fā)受到廣泛關(guān)注，深海魚類膠原蛋白最易被人體吸收[6]。魚類加工過程中產(chǎn)生大量廢棄物，如魚皮、魚鱗和鰭，可成為新的膠原蛋白資源，既降低了生產(chǎn)成本，又減少了環(huán)境污染[7]。而魚皮中膠原含量比其它部位高很多，最高可超過其蛋白質(zhì)總量的80%[8-9]。近年來，平鰭旗魚[10]、阿拉斯加鱈魚[11]、海鰻[12]、紅鰭東方鲀[13]等海洋魚類的魚皮相繼被用來提取膠原蛋白。

鮭魚被稱為“水中至尊”，魚皮中存在大量膠原蛋白，作者以鮭魚皮為原料提取明膠，進(jìn)一步采用木瓜蛋白酶酶解明膠制備低相對(duì)分子質(zhì)量膠原蛋白肽，并通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干鮭魚皮：北海斯麥兒貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶（酶活1.23×105U/g生化試劑）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

Free-Zone型真空冷凍干燥機(jī)：美國(guó)LABCONCO公司產(chǎn)品；TU-1901型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品；高效液相色譜Agilent 1100：美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；高效液相色譜Waters1525及紫外檢測(cè)器 Waters2487：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚皮前處理 干鮭魚皮切成0.4 cm×0.4 cm碎塊，清洗，0.1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，水洗至中性，正己烷浸泡24 h，去離子水沖洗干凈。

1.2.2 明膠的提取及純化 參考文獻(xiàn)[15]，稍作改動(dòng)。取適量處理后的鮭魚皮，加入6倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的H2SO4以200 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌40 min，去離子水沖洗至中性，再加入6倍體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的 檸檬酸同一轉(zhuǎn)速攪拌40 min，去離子水沖洗至中性，最后加入10倍體積去離子水，45℃恒溫水浴攪拌過夜，先用2層紗布過濾，再將濾液以6 000 r/min離心20 min。上層清液中加入NaCl鹽析48 h，8 000 r/min離心15 min，沉淀溶于0.5 mol/L醋酸溶液中，0.1 mol/L醋酸溶液透析24 h，再用去離子水透析48 h，每12 h換一次透析液，真空冷凍干燥后得到純度較高的鮭魚皮明膠。

1.2.3 明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 根據(jù)GB/T 9695.23-2008[16]，采用分光光度法，通過測(cè)定樣品中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，將羥脯氨酸含量乘以系數(shù)11.1[17]，即得到原料鮭魚皮中明膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.4 紫外光譜掃描 將明膠樣品溶解于0.5 mol/L醋酸溶液中，配成1 mg/mL溶液，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.5 氨基酸組成分析 稱120 mg明膠，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，真空封管，110℃水解22 h，水解液定容，過濾，移取1 mL濾液放入真空干燥器內(nèi)過夜干燥。加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶液，靜置1 h后，10 000 r/min離心10 min，取0.4 mL上清液進(jìn)行氨基酸組成分析。

1.2.6 木瓜蛋白酶水解明膠的單因素實(shí)驗(yàn) 酶解初始條件為底物濃質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，加酶量5%，溫度55℃，pH 7.0，水解時(shí)間2.5 h。水解過程中采用pH-stat法測(cè)定酶解液的水解度[18]，通過加入已知濃度的NaOH溶液保持酶解液pH不變，記錄堿消耗量，計(jì)算水解度（DH）[19]。

1.2.7 膠原蛋白肽制備的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以水解度為指標(biāo)，按照L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表綜合考慮蛋白酶最適pH、最適溫度、加酶量以及底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)膠原蛋白水解度的影響，結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table1 Levelsand factorsoforthogonaldesigned experiments

1.2.8 相對(duì)分子質(zhì)量分布 將上述制備的明膠和肽溶于超純水中，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL的試液，過膜。分析儀器：Waters 1525；色譜柱 TSK-gel G2000SWXL，流動(dòng)相：V（三氟乙酸）∶V（乙腈）∶（水）=0.1∶40∶60；流量：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 明膠提取率及純度分析

由分光光度法得到羥脯氨酸回歸方程：

A=0.190 1C-0.011 8

式中：A為吸光值；C為羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)；相關(guān)系數(shù)為R2=0.995 8，相關(guān)性良好。由此得到鮭魚皮中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.19%，乘以換算系數(shù)11.1，得到鮭魚皮中明膠總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為46.51%。粗提物得率為28.12%，明膠提取率為60.46%。粗明膠中羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.56%，由此得明膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.92%。

2.2 紫外光譜分析

蛋白質(zhì)分子含有能夠吸收某一波長(zhǎng)光的紫外生色基團(tuán)，各種紫外生色基團(tuán)的加和使蛋白質(zhì)分子有一定的紫外吸收[20]。由圖1可見，得到的鮭魚魚皮提取液的紫外最大吸收峰在233 nm，符合明膠的紫外吸收特征，主要是肽鍵C=O電子n→π*和n→σ*躍遷產(chǎn)生的強(qiáng)吸收。鮑士寶等研究鮰魚皮膠原蛋白的紫外最大吸收峰為233 nm[21]，與作者提取得到的明膠紫外最大吸收峰結(jié)果相似。而芳香族氨基酸色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）中含有共軛雙鍵，其中Trp和Tyr在280 nm附近有紫外吸收，Phe在257 nm處有紫外吸收[22]，而Trp在280 nm處的紫外吸收最強(qiáng)，但明膠中幾乎不含Trp，所以在280 nm處無強(qiáng)吸收峰。本實(shí)驗(yàn)中的明膠在250～280 nm處有極弱的紫外吸收峰，說明含有少量的Phe等芳香族氨基酸，與表2中氨基酸分析結(jié)果一致。因此，紫外吸收光譜表明經(jīng)酸浸-水提法得到純度較高的鮭魚皮明膠。

圖1 鮭魚皮明膠紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of the gelatin from salmon skin

表2 鮭魚皮明膠的常規(guī)氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of gelatin from salmon skin

2.3 氨基酸組分分析

明膠的氨基酸組成有其特點(diǎn)，甘氨酸約占氨基酸總質(zhì)量的30%，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）含量較高，其中脯氨酸約占氨基酸總質(zhì)量的10%，而羥脯氨酸作為明膠的特征氨基酸含量較高，并且明膠不含或含極少量的半胱氨酸和色氨酸，對(duì)于絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)而言，脯氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較少，目前只有膠原蛋白的脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過10%[23]。

表2中列出了鮭魚皮明膠的氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為34.4%，其次為丙氨酸和脯氨酸，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.01%、11.57%，亞氨基酸總含量為16.67%，甘氨酸和亞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占總氨基酸的50%。芳香族氨基酸及含硫氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)極少。因此，通過對(duì)表2中氨基酸組成的分析可知，實(shí)驗(yàn)得到的是純度較高的鮭魚皮明膠。宋芹等[24]研究羅非魚皮膠原蛋白中甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為32.28%，丙氨酸及脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.36%、11.74%，羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.17%，與鮭魚皮明膠相比略有差異。

2.4 木瓜蛋白酶水解明膠的單因素實(shí)驗(yàn)

作者考察了酶解時(shí)間、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、加酶量、pH、溫度對(duì)木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠反應(yīng)的影響。

由圖2（a）可知，反應(yīng)一開始，水解度隨時(shí)間變化很快。1 h后，水解速度減慢，水解度變化也趨于平緩。2.5 h后，水解度幾乎不隨時(shí)間的變化而變化，水解反應(yīng)及其緩慢，故水解時(shí)間選定為2.5 h。

由圖2（b）可以看出，底物濃度與水解度呈正相關(guān)性，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)大于8%時(shí)，水解度呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)椋孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)低會(huì)降低底物與酶分子結(jié)合機(jī)率，影響酶促反應(yīng)的速率，底物濃度增大使得酶作用點(diǎn)增加，水解度增大。而繼續(xù)增大底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，使得水解液過于黏稠，酶無法在水解液中完全擴(kuò)散，酶解效率降低，水解度下降。所以底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)選定為8%。

由圖2（c）可以看出，加酶量增大，水解度隨之增大，當(dāng)加酶量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%時(shí)，酶解速度開始變慢。因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍?，只能打開相應(yīng)位點(diǎn)上的肽鍵，當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，所有肽鍵均被打開后，水解度基本不會(huì)再變化。所以加酶量選定為質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%。

由圖2（d）可知，pH作為酶解反應(yīng)的主要因素，水解度隨著pH值的增大而增大，當(dāng)pH為8.0時(shí)水解度最大，繼續(xù)增大pH，水解度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。主要是因?yàn)閜H過高或過低都可能使酶分子變性。另外，在酶解反應(yīng)過程中，酶解液pH的變化會(huì)影響酶的活性部位及其附近的解離基團(tuán)與底物的結(jié)合，同時(shí)底物的解離也受pH變化的影響，因此確定適宜pH值為8.0。

溫度是影響酶解反應(yīng)的主要因素。由圖2（e）可知，溫度與水解度也呈正相關(guān)性，水解溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度最大，此后繼續(xù)升高溫度，水解度開始降低。這是因?yàn)榈蜏厥姑概c底物的碰撞機(jī)率降低，高溫使酶失去活性。所以水解溫度選定為55℃。

由單因素實(shí)驗(yàn)得到木瓜蛋白酶水解鮭魚皮膠原蛋白的最優(yōu)條件為：酶解時(shí)間2.5 h、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 8%、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù) 7%（8 610 U/g）、pH 8.0、溫度55℃，該條件下水解度為12.27%。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表3分析可知，各因素對(duì)木瓜蛋白酶水解明膠制備膠原蛋白肽水解率的影響次序?yàn)?A＞C＞D＞B，即加酶量＞酶解溫度＞pH＞底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。通過極差分析得到最優(yōu)水平為A2B3C3D3，即酶解時(shí)間2.5 h，加酶量7%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù) 10%，酶解溫度60℃，pH8.5。而根據(jù)水解度數(shù)據(jù)分析得到較優(yōu)的組合為A2B3C2D2。以上2種水平組合分別進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，平均水解度分別為12.53%和12.65%。水解度較高的是A2B3C2D2，即酶解時(shí)間2.5 h，加酶量7%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，酶解溫度55℃，pH 8.0。

圖2 木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠的單因素實(shí)驗(yàn)Fig.2 Optimization of reaction conditions of enzyme hydrolysis of gelatin from salmon skin

表3 鮭魚皮明膠酶解反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)分析Table 3 Orthogonalarray experimentalresults of enzymatic hydrolysis reaction of gelatin from salmon skin

2.6 魚皮膠原蛋白肽相對(duì)分子質(zhì)量分布

圖3和表4反映了酸浸-水提法提取的鮭魚皮明膠相對(duì)分子質(zhì)量情況，相對(duì)分子質(zhì)量大于10 000的占96.7%，主要集中在25 000，還有少部分成為游離氨基酸。圖4和表5反映了木瓜蛋白酶水解鮭魚皮明膠得到的膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布情況，相對(duì)分子質(zhì)量在3 000以下的占99.73%，并且主要集中在1 000以下，約占91.5%。

圖3 鮭魚皮明膠相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.3 Molecular weight distribution profile of gelatins from salmon skin

圖4 鮭魚皮膠原蛋白肽相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution profile of collagen peptides from salmon skin

表4 鮭魚皮明膠的相對(duì)分子質(zhì)量分布Table 4 Molecular range of gelatin from salmon skin

3 結(jié)語

以鮭魚皮為原料通過酸浸-熱水抽提法提取得到明膠，提取率為60.46%，明膠純度為83.92%。經(jīng)紫外光譜掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為233 nm，并通過氨基酸分析進(jìn)一步確定提取物為純度較高的明膠，符合明膠的理化特征。選用木瓜蛋白酶對(duì)明膠進(jìn)行水解，并通過單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，確定最優(yōu)酶解條件為：水解時(shí)間2.5 h，加酶量7%，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，酶解溫度55℃，pH8.0，該條件下水解度為12.65%。制備的膠原蛋白肽相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在1 000以下，占到91.5%，屬小相對(duì)分子質(zhì)量膠原蛋白肽。