邊祥海 孫貴富
肝癌惡性程度較高,預后較差,死亡率高,提高肝癌治愈率及生存期是肝癌研究的重點和難點。研究[1-2]證實,肝癌的發(fā)生與相關基因甲基化有關,正常肝臟、肝硬化、肝癌組織中,腫瘤抑制基因甲基化程度呈逐漸增強態(tài)勢,且差異明顯。地西他濱是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的用于治療骨髓增生異常綜合征表觀遺傳學的去甲基化藥物,可以抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶,激活沉默的抑癌基因[3]。三氧化二砷具有誘導腫瘤細胞分化,促進凋亡及細胞毒作用,小劑量聯(lián)合用藥有望成為肝癌治療的新出路[4-5]。本研究主要探討兩藥對肝癌SMMC-7721細胞株P15抑癌基因及甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達影響。
1.1 材料與試劑 肝癌SMMC-7721細胞株引自中科院上海細胞生物研究所;地西他濱注射液(decitabine,DAC,山東魯南制藥集團,批號098150301,規(guī)格50mg/瓶);三氧化二砷注射液(arsenic trioxide,As2O3,北京雙鷺藥業(yè)股份公司,批號20130304,規(guī)格10mg/瓶);四甲基偶氮唑鹽購于美國Sigma公司(批號M2128);M-MLV試劑盒購于上海Sangon公司(批號RP1100-50T)。
1.2 細胞培養(yǎng) SMMC-7721細胞株用含10%熱滅活胎牛血清(56℃,滅活30min)的RPMI 1640培養(yǎng)基,置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2~3天傳代1次,取對數(shù)生長期細胞進行實驗。
1.3 MTT法檢測各組對肝癌SMMC-7721細胞株的生長抑制率 取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板,調(diào)整密度為 1×104/mL,每孔接種 200μL,DAC 藥物組調(diào)整工作濃度分別為 1.0mmol/L、2.0mmol/L、4.0mmol/L,As2O3組工作濃度分別為 1.0μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L,聯(lián)合用藥組工作濃度為DAC2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L,空白對照組加入等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液和等量的SMMC-7721細胞懸液,每個濃度設5個復孔。分別培養(yǎng)24、48、72h后加入20μL的 MTT(5mg/mL),繼續(xù)孵育 4h,離心棄上清,加入DMSO 200μL/孔,上微型混合器震蕩 20min,使結晶完全溶解。酶標儀測570nm處吸光度OD值。細胞增殖抑制率=(OD對照組-OD藥物處理組)/OD對照組×100%。
1.4 RT-PCR檢測P15INK4B、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferases,DNMT1)、DNMT3A、DN MT3B 的mRNA的表達 收集1.3下藥物處理細胞,每組約2×106個細胞,按Trizol法提取細胞mRNA,配制模板RNA/引物混合液,DNA按試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,基因引物由上海生工基因公司合成:β-actin:上游 5′-CTAATAAGAAAAAGATCAACT-3′; 下游5′-AATCTTTGAAAATATTATTGC-3′(擴增產(chǎn)物 497 bp);P15INK4B:上游 5′-TGGGGGCGGCAGCGATGA G-3′;下游 5′-AG-GTGGGTGGGGGTGGGAAAT-3′(擴增產(chǎn)物 450bp);DNMT1:上游 5′-ACCGCTTCTAC TTCCTCGAGGCCTA-3′;下游 5′-GTTGCAGTCCTCT GTGAACACTGTGG-3′(擴增產(chǎn)物335bp);DNMT3A:上游 5′-CACACAGAAGCATATCCAGGAGTG-3;下游 5′-AGTGGACTGGGAAACCAAATACCC-3′(擴增產(chǎn)物 551bp);DNMT3B:上游 5′-AATGTGAATCCAG CCAGGAAAGGC-3′;下游 5′-ACTGGATTACACTCC AGGAACCGT-3′(擴增產(chǎn)物 190bp)。PCR 體系包括:上下游引物各 1μL,Taq DNA合成酶混合型12.5μL,模板 DNA2μL,P15INK4B的 PCR 反應條件:94℃預變性 5min,94℃ 1min,57℃ 45s,72℃ 60s,βactin反應共25個循環(huán),P15反應共30個循環(huán),72℃延伸5min。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的 25μL;PCR體系包括∶逆轉(zhuǎn)錄反應產(chǎn)物2μL,上游及下游引物各1μL,Taq DNA 合成酶混合型 12.5μL;反應參數(shù)為:94℃預變性 5min,94℃30s,55℃ 30s,72℃ 60s,DNMT1、DNMT3A 反應共 30 個循環(huán),DNMT3B反應共35個循環(huán),72℃延伸5min。取反應產(chǎn)物 5μL,1.5%瓊脂糖凝膠電泳(1V/cm),凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)記錄,ImageJ軟件分析。
1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)+標準差(±s) 表示,多組比較用F檢驗,組間兩兩比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞增殖抑制率比較 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞具有生長抑制作用,具有劑量和時間依賴性,聯(lián)合組優(yōu)于地西他濱和As2O3單藥組(P<0.05),見表1。
表1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞增殖抑制率比較(%,±s)
表1 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞增殖抑制率比較(%,±s)
注:DAC:地西他濱;As2O3:三氧化二砷;聯(lián)合組:DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L
組別空白組DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F-24h 0 5.2±0.3 16.4±0.6 30.7±0.6 9.7±0.5 33.2±0.5 34.3±0.6 55.8±0.8 9.277<0.05 48h 0 11.2±0.4 19.1±0.4 22.6±0.4 12.8±1.3 37.5±0.5 38.2±0.3 57.1±3.7 11.317<0.05 72h 0 15.6±1.1 24.1±0.7 33.8±0.7 14.9±0.8 45.5±1.2 47.9±2.5 69.9±1.2 15.287<0.05 P-10.314 9.334 13.302 12.368 7.685 9.012 8.525<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 F P
2.2 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞P15INK4B基因表達的影響 肝癌SMMC-7721細胞株的P15INK4B基因不表達或弱表達,經(jīng)地西他濱和(或)As2O3作用72h后P15INK4B基因表達增強,具有劑量依賴性,聯(lián)合組較單藥組比較表達明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表 2。
表2 地西他濱和(或)三氧化二砷對SMMC-7721細胞P15INK4B基因表達的影響(±s)
表2 地西他濱和(或)三氧化二砷對SMMC-7721細胞P15INK4B基因表達的影響(±s)
注:DAC:地西他濱;As2O3:三氧化二砷;聯(lián)合組:DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L
組別空白組As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F P灰度值0.38±0.16 0.34±0.12 0.43±0.14 0.56±0.11 0.33±0.14 0.44±0.19 0.57±0.15 0.74±0.14 22.313<0.05
2.3 地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B基因表達的影響 經(jīng)地西他濱和(或)As2O3作用72h后,SMMC-7721細胞甲基轉(zhuǎn)移酶 DNMT3B、DNMT3A和DNMT1mRNA水平下降,具有劑量依賴性,聯(lián)合組與單藥組比較表達水平下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表 3。
表3 地西他濱和(或)三氧化二砷對SMMC-7721細胞甲基轉(zhuǎn)移酶的影響(±s)
表3 地西他濱和(或)三氧化二砷對SMMC-7721細胞甲基轉(zhuǎn)移酶的影響(±s)
注:DAC:地西他濱;As2O3:三氧化二砷;聯(lián)合組:DAC 2.0mmol/L+As2O32.0μmol/L
組別空白組As2O31.0μmol/L As2O32.0μmol/L As2O34.0μmol/L DAC 1.0mmol/L DAC 2.0mmol/L DAC 4.0mmol/L聯(lián)合組孔數(shù)5 5 5 5 5 5 5 5 F P DNMT3A 0.76±0.12 0.68±0.11 0.58±0.14 0.41±0.13 0.64±0.14 0.50±0.15 0.36±0.13 0.28±0.11 11.297<0.05 DNMT3B 0.75±0.16 0.67±0.13 0.57±0.15 0.45±0.16 0.67±0.15 0.54±0.14 0.39±0.12 0.32±0.13 16.300<0.05 DNMT1 0.77±0.16 0.69±0.12 0.58±0.16 0.44±0.12 0.65±0.14 0.59±0.14 0.44±0.19 0.31±0.15 17.453<0.05
研究[1-2]證實肝癌的發(fā)生與DNA甲基化具有密切關系。在肝癌中,CpG島的啟動子高甲基化與抑癌基因沉默、轉(zhuǎn)錄抑制相關[6]。地西他濱通過抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,減少DNA的甲基化,從而抑制腫瘤細胞增殖[7]。樊伍峰等[8]研究發(fā)現(xiàn),地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉可以通過激活MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路抑制肝癌細胞HepG2的增殖。三氧化二砷為中藥砒霜的主要成分,我國學者首創(chuàng)其用于治療急性早幼粒細胞白血病,取得重大突破[4],研究[9]表明其對肝癌具有一定的治療作用。2011年9月衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中明確指出亞砷酸注射液為第一個經(jīng)多中心臨床研究證明有效而獲國家食品藥品監(jiān)管局批準用于肝癌治療的系統(tǒng)性化療藥物。孟真等[10]研究發(fā)現(xiàn),三氧化二砷具有去甲基化作用。彭土生等[11]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能抑制肝HepG2細胞的黏附、遷移和侵襲能力。李海燕等[12]發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能夠抑制人肝癌SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力,機制可能與甲基化有關。郝立曉等[13]綜述了近年來三氧化二砷聯(lián)合藥物治療肝癌方面的最新進展,發(fā)現(xiàn)三氧化二砷藥物聯(lián)合治療肝癌療效確切。
本研究顯示,地西他濱和三氧化二砷對SMMC-7721細胞具有生長抑制作用,具有濃度和時間依賴性(P<0.05)。本研究預實驗顯示,地西他濱在 1.0~4.0mmol/L濃度范圍之間,三氧化二砷在1.0~4.0μmol/L濃度范圍之間對肝癌SMMC-7721細胞株有較理想的增殖抑制作用,呈一定的時間、劑量依賴關系(P<0.05)。為實現(xiàn)低毒高效的抗肝癌細胞目的,根據(jù)等效半量相加法的聯(lián)合用藥原則,筆者選取三氧化二砷和地西他濱的中間劑量組成聯(lián)合組,同單用藥比較,抑制率均比單用藥高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。但是,兩藥聯(lián)合的最佳劑量組合,仍待進一步的研究。
研究[14]證實,肝癌中的腫瘤抑制基因與啟動子的高甲基化狀態(tài)有關,而這些基因在調(diào)節(jié)細胞周期、凋亡、黏附、侵襲及DNA修復中具有關鍵作用。周期依賴激酶抑制基因P15通常被認為是肝癌錯亂甲基化的靶點之一,INK4B基因表達P15蛋白,該蛋白質(zhì)是細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制性調(diào)節(jié)蛋白[15]。在許多組織中都有表達,其主要功能是通過與細胞周期依賴激酶結合,使細胞周期阻滯于G1期,從而抑制細胞增殖。DNMT1是最先被克隆的特異DNA甲基轉(zhuǎn)移酶,正常組織可呈持續(xù)低表達,其在維持基因甲基化狀態(tài)中起重要作用。DNMT3A和DNMT3B是近來被克隆的另兩種形式的甲基轉(zhuǎn)移酶,正常組織中不表達或低表達,兩者只對CpG位點甲基化修飾,是CpG位點胞嘧啶特異的DNA重新甲基轉(zhuǎn)移酶[16]。甲基轉(zhuǎn)移酶的異常激活,尤其是甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B的異常激活,可能導致肝癌細胞某些功能基因的啟動子高度甲基化,進而可能引起包括P15INK4B基因在內(nèi)的多種功能基因表達失活。彭建新等[17]研究發(fā)現(xiàn),肝癌組織 DNMT1、3A、3BmRNA 顯著高于其在癌旁組組織/肝硬化組織和慢性肝炎組織中的表達。我們對肝癌細胞株SMMC-7721的體外研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)地西他濱和(或)As2O3作用72h后,P15INK4B基因表達增強,聯(lián)合組較單藥組表達明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3Bm-RNA、DNMT3A和DNMT1mRNA的水平下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);地西他濱聯(lián)合三氧化二砷同單藥比較差異有統(tǒng)計學意義。
綜上所述,地西他濱和三氧化二砷對肝癌SMMC-7721細胞株有增殖抑制作用,并可抑制甲基化轉(zhuǎn)移酶,增加P15INK4B抑癌基因表達,兩藥聯(lián)合具有協(xié)同性。