譚華梁，肖麟，王小娟，蔣士生

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙 410007；2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3 湖南中醫(yī)藥研究院)

肝細(xì)胞癌(HCC)是一種原發(fā)性肝癌，是世界范圍內(nèi)第三大導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因，HCC高病死率主要?dú)w因于缺乏早期特異性診斷標(biāo)志物[1,2]。miR-7是microRNA家族成員，已被證實(shí)通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT等多種信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并影響腫瘤化療敏感性，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-7可抑制喉鱗癌、乳腺癌等癌細(xì)胞增殖和遷移[3～5]。硒蛋白P(SeP)是一種富含硒的糖蛋白，血漿中SeP主要由肝臟產(chǎn)生，起抗氧化損傷作用，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抗腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6]。Dewing等[7]研究表明，SeP是miR-7的特異性靶點(diǎn)。目前，HCC患者血清miR-7和SeP水平變化及意義尚未明確。2015年3月～2018年3月，我們檢測(cè)了HCC患者血清中miR-7和SeP水平，探討其在HCC早期診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月～2018年3月于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院首次確診為HCC的57例患者作為病例組，經(jīng)影像學(xué)、血清學(xué)等檢查符合 ESMO-ESDO臨床實(shí)踐指南中HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)病理學(xué)確診[8]，其中男36例、女21例，年齡41～76(60.35±11.47)歲。排除接受過(guò)化療、放療等癌癥輔助治療；合并其他臟器腫瘤患者；患有神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及血液系統(tǒng)疾病；合并全身炎癥性疾病，使用過(guò)非甾體類抗炎藥；臨床資料缺失者。

另選擇同時(shí)期體檢身體均健康的50例健康者作為對(duì)照組，無(wú)腫瘤相關(guān)病史及家族史，其中男27例、女23例，年齡40～80(62.41±12.58)歲。病例組和對(duì)照組性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有受試者對(duì)本研究知情并自愿參與；本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 HCC患者血清miR-7和SeP檢測(cè)方法 病例組患者入院后未治療前采集空腹肘靜脈血，對(duì)照組體檢當(dāng)日采集肘靜脈血，低溫離心，分離血清保存。①采用TRIzol?試劑提取血清總RNA，SuperScript Ⅳ逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得模板cDNA，使用Fast SYBR?Green Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)，以U6為內(nèi)參，檢測(cè)血清中miR-7相對(duì)表達(dá)量。miR-7正向引物：5′-AAAGAACATCCAGGCAAATGTGA-3′，反向引物：5′-CCGCCTAACGTACGCGCATATT-3′；U6正向引物：5′-CTGCGAAGCCGTGCTCA-3′，反向引物：5′-AGCGTTGAGCAATTAGCGT-3′。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑均購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher公司，引物合成于上海生工生物工程有限公司。②采用ELISA試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司)檢測(cè)兩組血清SeP水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-7和SeP水平比較 病例組、對(duì)照組血清miR-7相對(duì)表達(dá)量分別為0.52±0.16、1.18±0.43，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.775，P=0.000)；病例組、對(duì)照組血清SeP水平分別為(2.49±0.71)、(4.54±1.12)mg/L,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.447，P=0.000)。

2.2 病例組血清miR-7和SeP的關(guān)系 病例組血清miR-7水平與SeP水平呈正相關(guān)(r=0.487，P=0.013)。

2.3 血清miR-7和SeP水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤個(gè)數(shù)>1個(gè)患者血清miR-7相對(duì)表達(dá)量低于腫瘤個(gè)數(shù)1個(gè)患者(P<0.05)；腫瘤直徑≥5 cm患者血清miR-7相對(duì)表達(dá)量低于<5 cm患者(P<0.05)；血清miR-7相對(duì)表達(dá)量在不同分化程度、TNM分期及脈管是否侵犯方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；腫瘤直徑≥5 cm患者血清SeP水平低于<5 cm患者(P<0.05)；血清SeP水平在不同腫瘤個(gè)數(shù)、分化程度、TNM分期及脈管是否侵犯方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 血清miR-7和SeP水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系±s)

2.4 血清miR-7和SeP對(duì)HCC的診斷價(jià)值 血清miR-7單獨(dú)檢測(cè)診斷HCC的ROC曲線下面積(AUC)為0.830，95%CI為0.745～0.896，P<0.000 1；當(dāng)血清miR-7表達(dá)量≤0.62時(shí)，其診斷敏感度為75.44%，特異度為84.00%。血清SeP單獨(dú)檢測(cè)診斷HCC的AUC為0.934，95%CI為0.869～0.973，P<0.000 1；當(dāng)血清SeP水平≤3.24時(shí)，其診斷敏感度為80.70%，特異度為92.00%。血清miR-7聯(lián)合SeP檢測(cè)診斷HCC的AUC為0.966，95%CI為0.912～0.992，P<0.000 1；其診斷敏感度為89.47%，特異度為96.00 %。血清miR-7聯(lián)合SeP診斷HCC的效能最高。

3 討論

近年來(lái)，miRNA已成為一類新的潛在診斷生物標(biāo)志物，在癌癥檢測(cè)中具有高度準(zhǔn)確性[9]。miR-7是一類在不同物種間高度保守的miRNA分子，可通過(guò)多個(gè)靶基因在多種信號(hào)途徑中發(fā)揮調(diào)控作用[10]。研究報(bào)道，miR-7在肺癌中表達(dá)下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-7可通過(guò)下調(diào)CGG結(jié)合蛋白(CGGBP1)表達(dá)，抑制體外肺癌細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[11]。Xie等[12]研究報(bào)道，miR-7可通過(guò)靶向表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。以上研究結(jié)果證實(shí)miR-7在腫瘤進(jìn)展中的潛在作用。本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清中miR-7相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與肺癌、胃癌中研究結(jié)果一致，分析發(fā)現(xiàn)，miR-7表達(dá)與HCC患者腫瘤個(gè)數(shù)及直徑有關(guān)，提示miR-7在HCC中失調(diào)可能與腫瘤增殖及生長(zhǎng)有關(guān)。劉曉智等[13]研究表明，葉酸/聚酰胺-胺介導(dǎo)miR-7治療小鼠膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率明顯增加，提示葉酸/聚酰胺-胺介導(dǎo)miR-7可能是膠質(zhì)瘤新的有效基因治療方法。另有研究報(bào)道，雄激素受體介導(dǎo)的miR-7在前列腺癌去勢(shì)治療中發(fā)揮積極作用[14]。以上研究結(jié)果提示通過(guò)干預(yù)miR-7表達(dá)可能對(duì)腫瘤治療起積極作用。但miR-7對(duì)HCC癌細(xì)胞的作用尚需進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

硒是人體必需的一種微量元素，具有增強(qiáng)人體免疫力、保護(hù)心肌、促進(jìn)腦發(fā)育及預(yù)防癌癥發(fā)生、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等作用，在血漿中主要以含硒代半胱氨酸的SeP存在[15]。血漿中SeP可通過(guò)消除氧自由基，激活p53基因，防止DNA發(fā)生氧化損傷并具有修復(fù)基因功能，從而防止基因突變發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)原發(fā)性、繼發(fā)性及轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生的惡性腫瘤，給予適量硒補(bǔ)充均能降低腫瘤生長(zhǎng)率和晚期臨床分期[17]。田志帥等[18]研究表明，SeP在直腸癌中低表達(dá)，與腫瘤直徑、浸潤(rùn)漿膜有關(guān)，提示SeP參與直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Epplein等[19]研究報(bào)道，SeP是人體硒營(yíng)養(yǎng)的生物標(biāo)志物，而血液中硒水平低的成年人肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加。本研究結(jié)果顯示，HCC患者血清中SeP水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與患者腫瘤直徑有關(guān)，說(shuō)明SeP可能參與HCC的進(jìn)展過(guò)程。劉侃等[20]研究報(bào)道，在人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SeP亞型1基因，可引起細(xì)胞G2/M期阻滯，顯著降低細(xì)胞增殖能力。

目前，甲胎蛋白(AFP)是篩查及診斷肝癌的主要血清標(biāo)志物，但由于AFP在轉(zhuǎn)錄水平上受多種因素調(diào)控，其漏診率較高，且特異性較差[21]。近年來(lái)，肝癌新標(biāo)志物的探索研究發(fā)現(xiàn)，DKK1蛋白、GPC3、GP73等在肝癌診斷中表現(xiàn)出較好敏感性，但其診斷特異性和準(zhǔn)確性具有一定局現(xiàn)性[22]。研究表明，肝癌患者血清中SeP和miR-7水平與血清AFP水平呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示SeP和miR-7可能是肝癌臨床診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，此外，體外供給HCC癌細(xì)胞硒可明顯改變細(xì)胞中miR-7表達(dá)[23]。本研究相關(guān)性分析顯示，HCC患者血清中miR-7和SeP呈顯著正相關(guān)關(guān)系，推測(cè)補(bǔ)硒可能通過(guò)上調(diào)miR-7和SeP對(duì)HCC治療起積極作用。采用ROC曲線分析血清miR-7和SeP對(duì)HCC患者的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示血清miR-7和SeP單獨(dú)檢測(cè)診斷HCC的敏感度分別為75.44%、80.70%，特異度分別為84.00%、92.00%，而聯(lián)合檢測(cè)診斷HCC的敏感度和特異度分別為89.47%、96.00%，均高于其單獨(dú)檢測(cè)，說(shuō)明血清miR-7和SeP對(duì)HCC有較好診斷價(jià)值，聯(lián)合檢測(cè)準(zhǔn)確度更高。

綜上所述，HCC患者血清中miR-7和SeP水平均降低，可能參與HCC發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)HCC有較高的診斷價(jià)值。但本研究納入病例數(shù)較少，結(jié)果可能具有一定偏倚性，下一步將繼續(xù)在擴(kuò)大樣本基礎(chǔ)上探討miR-7和SeP在HCC治療及預(yù)后中的作用。