李思漫，張金秀，朱曄，葉喆，彭鵬，黃杰安

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南寧530021)

根據(jù)國(guó)家癌癥中心2018年最新發(fā)表的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率居所有腫瘤第3位，而患者病死率高居所有腫瘤第5位。雖然近年來針對(duì)結(jié)直腸癌的治療手段不斷豐富，但由于其發(fā)病較為隱匿，早期即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，一旦轉(zhuǎn)移則術(shù)后效果不佳，生存率不高。結(jié)直腸癌的發(fā)生是黏膜上皮受到遺傳和環(huán)境等多種因素作用導(dǎo)致多基因改變及相互作用的結(jié)果，但其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制至今尚未明了[1]。因此探討結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和尋求新的腫瘤標(biāo)記物是攻克結(jié)直腸癌的重要課題。

細(xì)胞間緊密連接蛋白(Tricellulin)是緊密連接相關(guān)MARVEL蛋白家族的一員，在正常細(xì)胞中主要表達(dá)于三細(xì)胞間緊密連接處，是構(gòu)成和維持細(xì)胞間黏附功能的重要結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。Tricellulin表達(dá)增加能直接增強(qiáng)上皮細(xì)胞間黏附能力，缺失將致三細(xì)胞間緊密連接功能喪失、黏附能力下降，引起上皮細(xì)胞層屏障功能減弱,此時(shí)癌細(xì)胞易于擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞自噬是一把“雙刃劍”，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同作用，在腫瘤的早期生長(zhǎng)階段，自噬抑制腫瘤發(fā)生，而隨著腫瘤的生長(zhǎng)，為適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧環(huán)境，細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)自噬，從而保護(hù)自身，這一階段自噬則有保護(hù)腫瘤細(xì)胞的作用[3, 4]，因此細(xì)胞自噬對(duì)腫瘤有雙重作用。Beclin1是一種重要的自噬調(diào)控蛋白，研究表明，與正常組織相比，腫瘤組織自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[5,6]，且其表達(dá)程度與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等預(yù)后有關(guān)[7, 8]。LC3作為參與自噬發(fā)生的關(guān)鍵基因，其表達(dá)與自噬活性關(guān)系密切, LC3的異常表達(dá)與多種惡腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[9]。三者均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，但在結(jié)直腸癌中Tricellulin是否通過細(xì)胞自噬參與調(diào)控人結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展仍不明確。2018年4月，我們觀察了結(jié)直腸癌組織中Tricellulin、LC3、Beclin1的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年4月～2017年7月未接受放化療、經(jīng)外科手術(shù)切除的標(biāo)本145例份，其中距離癌旁10 cm的正常結(jié)直腸黏膜組織76例份、結(jié)直腸癌組織69例份，患者年齡32～75(57.70±10.94)歲，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。其中結(jié)直腸癌患者男42例、女27例，腫瘤浸潤(rùn)至黏膜或肌層9例，深肌層以下60例;TNM 分期Ⅰ期7例，Ⅱ期39例，Ⅲ期14例，Ⅳ期9例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例;遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移9例。

1．2 結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中Tricellulin、LC3和Beclin1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化SP染色法。組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟包埋，制成4 μm厚連續(xù)切片。結(jié)腸組織切片常規(guī)脫蠟、脫水，以 0.01 mol/L枸櫞酸高壓修復(fù)6 min，3% H2O2室溫孵育12 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3×5 min,正常山羊血清室溫封閉12 min后，滴加一抗 (Tricellulin濃度為1∶100，Beclin1濃度為1∶500,LC3濃度為1∶200)，置于濕盒中4 ℃孵育過夜，第2天復(fù)溫至少30 min，PBS洗3×5 min，DAB顯色6 min，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。陽性對(duì)照由北京博奧森生物技術(shù)有限公司和北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照(其余步驟同上)。以細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的黃色或黃褐色顆粒為SP免疫組化染色陽性，綜合染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行半定量分析。用Olympus顯微鏡及顯微攝像儀對(duì)染色組織切片進(jìn)行觀察。根據(jù)免疫陽性細(xì)胞染色程度(A)計(jì)分：無染色為0分；胞膜/胞質(zhì)/胞核內(nèi)見淡黃色顆粒計(jì)1分，較多棕黃色顆粒計(jì)2分；大量棕黃色顆粒計(jì)3分。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算染色陽性細(xì)胞所占比例(B)：陽性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。A與B相加為其最后得分，0分判為“-”，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”，以“++”和“+++”定義為陽性表達(dá)，“-”和“+”定義為陰性表達(dá)。

1.3 正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞及結(jié)直腸癌細(xì)胞中Tricellulin、LC3和Beclin1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集提取正常結(jié)直腸上皮NCM460細(xì)胞總蛋白，結(jié)直腸癌HT29、HCT116、RKO、SW620細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，每樣本上樣量為300 μg，經(jīng)12%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA室溫封閉1 h后，分別加入兔抗人Tricellulin(1∶800)、Beclin1(1∶800)、LC3(1∶800)和GAPDH(1∶2 000)一抗中，4 ℃條件下?lián)u床孵育過夜，次日經(jīng)TBST洗滌后，加入IRDye680RD標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h，經(jīng)Odyssey紅外成像分析儀(LI-COR 公司)掃膜顯影，以GAPDH蛋白為內(nèi)參照對(duì)以上目的蛋白進(jìn)行灰度值分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白D值/內(nèi)參照D值。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化染色結(jié)果 Tricellulin在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有表達(dá)；LC3和Beclin1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，見圖1。

注:A1、B1、C1分別為Tricellulin、LC3及Beclin1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(×400，SP染色)；A2、B2、C2分別為Tricellulin、LC3及Beclin1在正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)(×400，SP染色)。

圖1Tricellulin、LC3和Beclin1在結(jié)直腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)

2．2 結(jié)腸癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中Tricellulin、LC3和Beclin1陽性表達(dá)率比較 正常結(jié)直腸黏膜組織與結(jié)直腸癌組織中Tricellulin陽性表達(dá)率分別為48.68%(37/76)、69.57%(48/69)，二者比較，P=0.011；LC3陽性表達(dá)率分別為46.05%(35/76)、66.67%(46/69)，二者比較，P=0.013；Beclin1陽性表達(dá)率分別為43.42%(33/76)、65.22%(45/69)，二者比較，P=0.005。

2.3 Tricellulin、LC3和Beclin1在正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)比較 與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞相比，Tricellulin、LC3和Beclin1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),見表1。

表1 不同細(xì)胞中Tricellulin、LC3和Beclin1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(n=3，±s)

注：與NCM460細(xì)胞相比，*P<0.01。

2.4 Tricellulin、LC3和Beclin1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Tricellulin、LC3和Beclin1陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌患者腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)。見表2。

2．5 結(jié)直腸癌組織中Tricellulin、LC3與Beclin1表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中 Tricellulin與LC3、Beclin1表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0．334、0.377，P均<0.05)，LC3與Beclin1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.323，P<0.05)。

3 討論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與結(jié)腸交界處。近年來，我國(guó)社會(huì)人口老齡化，加上飲食模式和生活習(xí)慣的改變，結(jié)直腸癌發(fā)病率逐年上升，且大部分患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，總體預(yù)后欠佳。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，Tricellulin具有加強(qiáng)三細(xì)胞間緊密連接進(jìn)而提高細(xì)胞間黏附的能力[10]，揭示其與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)；自噬基因調(diào)控機(jī)制失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[11]。

緊密連接是細(xì)胞間連接的主要結(jié)構(gòu)，其作用是介導(dǎo)細(xì)胞間黏附，封閉細(xì)胞間空隙并阻止溶液及其他大分子通過細(xì)胞旁途徑透過細(xì)胞層，以及作為阻止細(xì)胞遷移和運(yùn)動(dòng)的屏障在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)增殖中發(fā)揮關(guān)鍵作用。緊密連接主要由多種緊密連接蛋白組成，包括Occludin家族、Claudin家族和JAM家族。緊密連接主要有兩種形式：雙細(xì)胞間緊密連接和三細(xì)胞間緊密連接。其中雙細(xì)胞間緊密連接主要由Occludin和Claudin蛋白家族連接構(gòu)成。Tricellulin是在三細(xì)胞緊密連接處發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)緊密連接蛋白，由Ikenouchi團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道的第一個(gè)特異性地出現(xiàn)在三細(xì)胞間三個(gè)垂直方向集合區(qū)域的整合膜蛋白，Tricellulin是具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的編碼555個(gè)氨基酸的多肽(63.6 kD)，集中表達(dá)于三細(xì)胞接觸處，其N-端和C-末端位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)。Tricellulin與Occludin具有部分結(jié)構(gòu)相似性，COOH-末端序列(約130個(gè)氨基酸)在Tricellulin和Occludin之間保守，表明在功能上Tricellulin可能與跨膜蛋白Occludin形成部分重疊或二者在某些功能上共同發(fā)揮作用。編碼這兩種蛋白質(zhì)的基因在小鼠染色體13和人類染色體5上串聯(lián)，表明其可能在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化期間被復(fù)制[12]。研究[13]證實(shí)Tricellulin在整個(gè)身體組織和器官的上皮細(xì)胞連接處普遍表達(dá)，對(duì)人類全身的細(xì)胞分化、生長(zhǎng)增殖起重要作用。Tricellulin在肝癌、扁桃體鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)下調(diào)[14,15]，表明在腫瘤中Tricellulin表達(dá)降低，細(xì)胞間黏附功能下降從而增強(qiáng)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件。然而本研究中Tricellulin在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)較正常結(jié)腸黏膜組織高，且在惡性程度較高的腫瘤組織中有核移位現(xiàn)象。研究[16]發(fā)現(xiàn)，Tricellulin核濃聚能增加胰腺導(dǎo)管癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。因此Tricellulin的核移位可能是其表達(dá)量增加但功能降低的原因，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

表2 Tricellulin、LC3和Beclin1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上保守的分解代謝過程。正常生理情況下，細(xì)胞自噬利于細(xì)胞保持自穩(wěn)狀態(tài)，抑制細(xì)胞癌變；然而腫瘤一旦形成，細(xì)胞自噬為癌細(xì)胞提供更豐富的營(yíng)養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞通過自噬逃避凋亡，維持生存，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。因此，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞自噬扮演雙重角色。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30 的同源物，亦稱為BECN1，最早被認(rèn)為是一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)因子Bcl-2相互作用的蛋白。Beclin1為哺乳動(dòng)物中惟一被發(fā)現(xiàn)參與自噬的特異性基因，位于人類染色體17q21上，含有12個(gè)外顯子，由BH3、中央螺旋區(qū)(CCD)和進(jìn)化保守區(qū)(ECD)3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域是Beclin1與其他分子相互作用的部位。Beclin1是細(xì)胞自噬過程中最重要的正調(diào)節(jié)因子，Beclin1調(diào)控自噬通常是通過自身的3個(gè)結(jié)構(gòu)域與其他蛋白家族結(jié)合從而上調(diào)或下調(diào)自噬，如Ryter等[17]報(bào)道Beclin1與UVRAG、Bif-1和Ambral相偶聯(lián)可促進(jìn)自噬，而與Bcl-2相連可抑制自噬。Beclin1在人類癌癥中扮演重要角色，Yue等[18]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Beclin1單等位基因缺失會(huì)造成自發(fā)性的肺癌、肝癌和淋巴癌發(fā)生率明顯提高，由此提示Beclin1是一個(gè)重要的抑癌蛋白。研究[6]表明，與正常組織相比，Beclin1在腫瘤組織中呈高表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，在正常結(jié)直腸黏膜組織和結(jié)直腸癌組織中，Beclin1陽性表達(dá)率分別為43.42%(33/76)、65.22%(45/69)，兩種組織中Beclin1的陽性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，原因可能是在結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)階段，為適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺乏和低氧狀態(tài)，細(xì)胞會(huì)增強(qiáng)自噬，從而保護(hù)自身。

LC3作為參與自噬發(fā)生的關(guān)鍵基因，其表達(dá)與自噬活性關(guān)系密切,是監(jiān)測(cè)自噬的特異性標(biāo)志物。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3(即LC3-Ⅱ)。其中LC3-Ⅱ可通過活化Atg12，結(jié)合Atg5,從而參與形成自噬體。研究表明,LC3的異常表達(dá)與諸多惡性腫瘤(如胃癌、宮頸癌等)的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后關(guān)系密切[19]。Huang等[20]報(bào)道了LC3-Ⅱ在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中表達(dá)降低，自噬活性下降。于海等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中LC3的陽性表達(dá)明顯高于正常肝組織。本研究發(fā)現(xiàn)，LC3在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率(66.67%)高于正常結(jié)直腸黏膜組織(46.05%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明LC3表達(dá)及作用在不同類型腫瘤中有差異，其在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用及分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中Tricellulin、LC3和Beclin1陽性表達(dá)率高于正常結(jié)直腸黏膜組織，且Tricellulin、LC3和Beclin1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明Tricellulin、LC3和Beclin1與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Tricellulin、LC3與Beclin1表達(dá)呈正相關(guān)，提示Tricellulin可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中Tricellulin、LC3及Beclin1呈高表達(dá)，且呈正相關(guān)；Tricellulin可能通過調(diào)控細(xì)胞自噬共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。