楊 勇，劉 群，章帥文，李昆太

(江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045)

維生素B12(Vitamin B12)又叫鈷胺素，屬于咕啉類化合物，是唯一含金屬的維生素類化合物[1]。作為一種重要的生物活性物質(zhì)，維生素B12是許多重要生物化學反應(yīng)所必需的輔酶[2]，其參與的生化反應(yīng)過程包括了DNA的合成和調(diào)控、脂肪酸的合成、氨基酸的代謝及能量的產(chǎn)生等[3]。目前，維生素B12主要用于治療惡性貧血癥以及末梢神經(jīng)炎[4]。

由于維生素B12的分子結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，其全部化學合成需要多達70余個的反應(yīng)步驟[5]，且成本昂貴，故目前幾乎都是通過微生物發(fā)酵的方式來生產(chǎn)維生素B12[6]。自然界中，維生素B12的生物合成存在兩種不同的合成途徑，即好氧途徑與厭氧途徑[7]。這兩種合成途徑的本質(zhì)區(qū)別在于鈷離子螯合到咕啉環(huán)的時機不同以及中心咕啉環(huán)的縮合機制不同[8]。脫氮假單胞桿菌由于具有完整的維生素B12合成基因，可在好氧的條件下完成維生素B12的全合成，因而被廣泛開發(fā)應(yīng)用于維生素B12的發(fā)酵生產(chǎn)[9]。

假單胞菌屬(Pseudomonassp.)就是一類典型的具有ED代謝途徑的微生物，如嗜糖假單胞菌(P.Saccharophila)[10]，惡臭假單胞菌(P.putida)[11]、熒光假單胞菌(P.fluorescens)[12]等。有研究表明，假單胞菌屬對胞內(nèi)氧化環(huán)境較為敏感，其ED代謝途徑所產(chǎn)生的NADPH對于增強菌體對抗氧化應(yīng)激(oxidative stress)反應(yīng)的能力發(fā)揮著重要的作用[13]。例如，Singh等[14]在熒光假單胞菌培養(yǎng)過程中外源添加100 μmol/L的超氧生成劑甲萘醌(menadione)，結(jié)果表明菌體在氧化應(yīng)激狀態(tài)下會顯著抑制NAD+激酶(NAD+kinase，NADK)的酶活，并增強 NADP+磷酸酶(NADP+phosphatase，NADPase)的酶活，以增加胞內(nèi)NADPH 的供給并限制NADH 的合成。

盡管脫氮假單胞桿菌系典型的維生素B12好氧合成菌株，且合成過程中需提供大量的NADPH和ATP參與酶促反應(yīng)，但其是否會與惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌等假單胞菌類一樣，對胞內(nèi)氧化環(huán)境較為敏感？其ED代謝途徑是否也在抗氧化應(yīng)激并維持胞內(nèi)氧化還原平衡方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用？而甲萘醌作為一種超氧生成劑，可以進入細胞，經(jīng)單電子還原成半醌自由基，從而進入呼吸鏈與O2作用形成·O2-[15-16]，因此，外源添加甲萘醌可以起到添加活性氧的作用。為此，本文通過考察外源加入不同濃度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑——甲萘醌對脫氮假單胞桿菌代謝過程的影響，以期為接下來深入探究脫氮假單胞桿菌在氧化應(yīng)激狀態(tài)下的代謝輔因子變化規(guī)律，并明確其在維系菌體胞內(nèi)氧化還原平衡和維生素B12合成中的關(guān)鍵調(diào)控作用，為揭示限制性供氧促維生素B12高效合成的代謝機理尋求理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

脫氮假單胞桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，由本實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基 蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米漿10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.0～7.2。

1.2.2 種子培養(yǎng)基 蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2～7.4。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜堿10 g，5,6-二甲基苯并咪唑(DMBI) 0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去離子水1 000 mL。滅菌前調(diào)pH至7.2～7.4。

1.3 搖瓶發(fā)酵方法

種子液的制備：每支培養(yǎng)好的脫氮假單胞桿菌新鮮斜面(18×180 mm)加入10 mL無菌水，刮洗制備成菌懸液。以無菌吸管吸取2 mL菌懸液至裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶(裝液量為50 mL/250 mL三角瓶)中，在搖床上進行種子液的培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃,轉(zhuǎn)速180 r/min,培養(yǎng)至OD700為9～10。

搖瓶發(fā)酵：培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶(裝液量為40 mL/250 mL三角瓶)中，將無菌過濾好的甲萘醌溶液按照相應(yīng)的摩爾濃度梯度(濃度梯度分別為0，0.3，0.6，1.0 μmol/L)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、180 r/min下進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。

1.4 分析方法

菌體生物量的測定：發(fā)酵液取樣進行適當稀釋，以蒸餾水為對照，于波長700 nm處測定其吸光值。菌體的光密度(OD700)=OD讀數(shù)×稀釋倍數(shù)。

總糖測定：苯酚-硫酸比色法[17-18]。

維生素B12含量：取30 mL充分搖勻的發(fā)酵液于4 000 r/min離心10 min，去上清后加30 mL蒸餾水攪勻在上述相同條件下離心，倒去上清液后加入10 mL蒸餾水將菌體攪勻，加入質(zhì)量分數(shù)8%亞硝酸鈉溶液和冰乙酸各3 mL，搖勻，于95～100 ℃水浴30 min；水浴后冷卻至室溫，加蒸餾水定容至50 mL，過濾。所得濾液適當稀釋后，在波長為361 nm處進行紫外光譜分析，根據(jù)所繪制的標準曲線算出維生素B12含量[7]。

1.5 比生長速率，產(chǎn)物比生成速率，基質(zhì)比消耗速率，產(chǎn)物對基質(zhì)得率系數(shù)

式中：X為菌體生物量濃度(OD值表征)；P、S分別為產(chǎn)物濃度與基質(zhì)濃度，μg/mL；μ為比生長速率，h-1；t表示時間，h。

1.6 試驗數(shù)據(jù)的獲得與處理

在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，每隔24 h取樣，分別測定菌體生物量、pH、總糖以及維生素B12含量。每個實驗做3次平行實驗，取其平均值。

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)處理，origin 9.0軟件進行作圖與動力學參數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同甲萘醌濃度下菌體生長、基質(zhì)消耗和維生素B12合成的時序性動態(tài)變化

圖1 甲萘醌對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程基本參數(shù)的影響Fig.1 The effects of menadione on basic parameters of Pseudomonas denitrificans fermentation

由圖1可以看出，外源添加甲萘醌有利于菌體生物量的形成，其中尤以0.3 μmol/L甲萘醌最佳；在發(fā)酵前期，甲萘醌抑制細胞生長可能是因為甲萘醌對于細胞生長以及相關(guān)的酶系具有抑制作用，且高濃度甲萘醌抑制作用愈強，而發(fā)酵中后期可能菌體開始適應(yīng)胞外脅迫環(huán)境并利用甲萘醌。從pH變化曲線可以看出，添加甲萘醌對發(fā)酵液pH初始值基本無影響。在24～48 h高濃度甲萘醌下，pH呈現(xiàn)出先升高后下降趨勢，可能是高濃度甲萘醌導(dǎo)致部分菌體凋亡所致。隨著發(fā)酵的進行，菌體由于生長代謝會持續(xù)產(chǎn)生有機酸，導(dǎo)致對照組和試驗組pH均出現(xiàn)急劇下降。但是相對于對照組而言，添加甲萘醌能有效延緩發(fā)酵液pH的降低，可為菌體生長提供較為適宜的pH環(huán)境。隨著發(fā)酵的進行，菌體代謝不斷加劇，發(fā)酵液總糖含量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。與對照組相比，添加甲萘醌加速了菌體的糖耗，再一次反映了添加甲萘醌有利于菌體的生物量形成。另外，隨著甲萘醌濃度的增加，維生素B12產(chǎn)量也呈現(xiàn)出明顯的降低趨勢。盡管0.3 μmol/L甲萘醌濃度下的菌體生物量已達到最大值，但其維生素B12產(chǎn)量仍比對照組降低了7.5%，僅為56.82 μg/mL。

綜合以上結(jié)果可以得出結(jié)論，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲萘醌有利于菌體生長，并可優(yōu)先延緩發(fā)酵液pH的急劇降低，為菌體生長提供適宜的pH環(huán)境，但是會顯著抑制維生素B12的合成，且甲萘醌濃度越高，抑制作用越強。

2.2 不同甲萘醌添加濃度下的發(fā)酵動力學變化

選取0，0.3，0.6 μmol/L這3種甲萘醌濃度下的脫氮假單胞桿菌發(fā)酵代謝過程，分別計算出其菌體比生長速率(μ)、總糖比消耗速率(QS)、維生素B12比生成速率(QP)以及維生素B12對總糖的得率系數(shù)(YP/S)等動力學參數(shù)，結(jié)果如表1所示。在整個發(fā)酵過程的不同時段，甲萘醌試驗組的菌體比生長速率均高于對照組，再次說明了添加甲萘醌會加快菌體生長。其中，添加0.3 μmol/L甲萘醌時，其菌體平均比生長速率明顯較高于對照組，說明甲萘醌促菌體生長效果較為顯著。由總糖比消耗速率可知，甲萘醌試驗組整個發(fā)酵過程的總糖比消耗速率要高于對照組，這說明甲萘醌的添加會導(dǎo)致菌體總糖消耗量增加，原因是因為添加甲萘醌情況下，菌體生長代謝加快，因此糖耗加快。在發(fā)酵前48 h，由于菌體處于旺盛的對數(shù)生長期，總糖比消耗速率明顯高于發(fā)酵后期。由維生素B12比生成速率綜合可以發(fā)現(xiàn)，對照組在整個發(fā)酵過程的維生素B12平均比生成速率略高于甲萘醌試驗組，這說明甲萘醌對產(chǎn)物合成具有一定的抑制作用，可能是因為高氧化應(yīng)激狀態(tài)下，脫氮假單胞桿菌不得不將更多的NADPH用于抗氧化應(yīng)激并維持胞內(nèi)氧化還原平衡，從而使得流向維生素B12合成途徑的NADPH偏少，最終抑制維生素B12合成。此外，分析不同時段維生素B12對總糖的得率系數(shù)可知，對照組明顯高于試驗組，說明甲萘醌試驗組的糖耗更多用于菌體生長和代謝維持。

表1 添加甲萘醌對μ、YP/S、QS和QP的影響

3 結(jié)論與討論

微生物通過各種代謝途徑提供細胞生長和維持所需的能量、還原力以及不同中間代謝物的需求，其中糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas，EMP)途徑是許多微生物的主流糖分解代謝途徑，而恩特納-多多羅夫(Entner-Doudoroff，ED)代謝途徑則是某些微生物因缺乏完整的EMP途徑而采用的一種替代糖代謝途徑[19]。盡管ED途徑的產(chǎn)能效率不如EMP途徑，但是該途徑會生成NADPH，而NADPH恰恰是微生物胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，其作為電子供體參與胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)以維持胞內(nèi)正常的氧化還原平衡[20-21]。因此，有些兼性厭氧的環(huán)境微生物在進化過程中會選擇ED代謝途徑分解利用葡萄糖，以對抗并適應(yīng)其所處的外界氧化環(huán)境。

脫氮假單胞桿菌作為典型具有ED代謝途徑的微生物，并且Wang等[22]利用13C同位素標記代謝流分析的方法詳細考察了維生素B12產(chǎn)生菌脫氮假單胞桿菌的中心代謝網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)該菌與其它具有ED代謝途徑的惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌等假單胞菌類一樣，EMP途徑的代謝活性很低，主要利用ED途徑分解代謝葡萄糖。這似乎表明，脫氮假單胞桿菌對胞內(nèi)的氧化狀態(tài)較為敏感。然而，脫氮假單胞桿菌中的維生素B12合成又屬于典型的好氧合成途徑。那么，胞內(nèi)氧化狀態(tài)究竟會對脫氮假單胞桿菌代謝過程，尤其是維生素B12合成過程產(chǎn)生怎樣的影響，目前尚不清晰。甲萘醌作為一種強氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，王明星等[23]通過研究表明，適量添加甲萘醌能促進過氧化氫酶合成，且當甲萘醌濃度超過5 μmol/L 時，細胞生長明顯受到較大程度抑制作用。王業(yè)生等[24]研究得出：甲萘醌、二酰胺和H2O2呈濃度和時間依賴性抑制白色假絲酵母(CAL)菌絲形成，且甲萘醌抑制CAL菌絲形成作用最強。

為此，本文通過外源加入不同濃度氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌，考察了脫氮假單胞桿菌菌體生長、產(chǎn)物合成和基質(zhì)消耗等發(fā)酵過程參數(shù)的動力學變化，結(jié)果表明：添加甲萘醌可以加快脫氮假單胞桿菌菌體生長、加速總糖消耗，其中以0.3 μmol/L甲萘醌效果較為明顯，但是對維生素B12的合成具有一定的抑制作用。結(jié)合文獻[14]報道，可以分析得出，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑甲萘醌的加入雖然能顯著增強NADP磷酸酶的酶活，增加胞內(nèi)NADPH的供給，但同樣誘發(fā)了脫氮假單胞桿菌胞內(nèi)氧化環(huán)境的加劇，迫使菌體不得不將更多的NADPH用于抗氧化應(yīng)激并維持胞內(nèi)的氧化還原平衡，從而使得流向維生素B12合成途徑的NADPH偏少，從而最終影響維生素B12的合成量。