王鳳軍 葉素丹 包永華 周曉紅 凌 云

(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，杭州 310018)

大豆是世界最主要的油料作物，是人類優(yōu)質(zhì)蛋白和油脂的主要來源，自20世紀(jì)60年代以來，世界大豆生產(chǎn)迅速發(fā)展［1］。2016年轉(zhuǎn)基因大豆的播種面積高達(dá)9 140萬公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物總種植面積的一半［2－3］。從全球單個作物的種植面積來看，2016年轉(zhuǎn)基因大豆的應(yīng)用率為78%，高于轉(zhuǎn)基因棉花、玉米和油菜的應(yīng)用率?？瓜x/耐除草劑大豆(IntactaTM)在2003—2015年的應(yīng)用帶來了24億美元的經(jīng)濟(jì)效益，為全球74億人口提供了可獲得的糧食和營養(yǎng)［2］。從世界范圍來看，大豆種植的集中度非常高，主要集中在北美洲的美國、南美洲的巴西和阿根廷、亞洲的和印度等少數(shù)幾個國家。以上五個主產(chǎn)國大豆種植面積占全世界的85% ～90%，總占全世界的85% ～90%，單產(chǎn)高出世界平均水平5% ～10%［2］。

由于轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品可能存在潛在的環(huán)境污染，食用安全及生態(tài)風(fēng)險，對人類健康和自然環(huán)境帶來不利影響，因此，需要加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品的有效監(jiān)督、監(jiān)測和管理［4］。歐盟、日本、韓國、挪威等國明確規(guī)定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的限量標(biāo)準(zhǔn)并制定相應(yīng)法規(guī)實行轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識制度。我國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法也對包括大豆在內(nèi)的5大類17種市場流通的主要轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品要求必須加貼標(biāo)識［5］。而轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理制度必須以有效的外源基因檢測技術(shù)為基礎(chǔ)［6－7］。轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品大量投放市場已經(jīng)成為不可抗拒的潮流，建立適當(dāng)?shù)姆椒▽D(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品進(jìn)行檢測就顯得尤為重要。如蔡穎等［8］使用LAMP檢測方法對轉(zhuǎn)基因大豆A5547－127品系成分進(jìn)行鑒定;蘆春斌等［9］使用普通定性PCR對廣州市農(nóng)貿(mào)市場中轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行檢測;吳影等［10］使用實時熒光PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行定量篩查檢測和品系鑒定。但這些方法檢測范圍窄，效率低，迫切需要開發(fā)高通量的快速轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)。

多重實時熒光PCR技術(shù)(Real－time Quantita-tive PCR Detection System)是指在PCR反應(yīng)體系中加入序列特異性的多個熒光探針，探針根據(jù)靶序列設(shè)計，5’端含有不同波長的報告熒光基團(tuán)，3’端含有非熒光的猝滅基團(tuán)，與擴(kuò)增的靶序列特異性結(jié)合。Taq酶的外切核酸酶活性將探針的熒光報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相分離，發(fā)出熒光信號，使熒光信號的積累與擴(kuò)增產(chǎn)物的形成完全同步。在實驗設(shè)計過程中，不同探針可以用不同報告基團(tuán)(不同顏色的熒光信號)標(biāo)記，實現(xiàn)在一個反應(yīng)體系中同時對多個靶標(biāo)基因的定性、定量檢測，且相互間無信號干擾［11－12］。如Koppel等開發(fā)了可同時檢測啟動子和終止子的二重實時熒光PCR篩查檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品［13－14］。本課題組前期也建立了可同時檢測番茄內(nèi)源基因和三個外源基因的四重實時熒光PCR方法，可實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因番茄產(chǎn)品的高效準(zhǔn)確檢測［15］。

本實驗通過提取樣品核酸，檢索與篩選外源靶標(biāo)基因，設(shè)計與驗證特異性引物及多重?zé)晒馓结?，?yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，分析特異性、重復(fù)性和靈敏性等，開發(fā)建立了可同時檢測內(nèi)源基因Lectin和外源基因CaMV35S、nos的多重?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)。本方法的建立將對大豆及其深加工制品中轉(zhuǎn)基因成分的全程監(jiān)測和快速監(jiān)控，確保食品安全有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因陽性樣品:CNAS T025－24轉(zhuǎn)基因大豆粉(遼寧出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心組織的PTCT025能力驗證)，F(xiàn)APAS GeMSU 56A/56B轉(zhuǎn)基因玉米粉(英國FAPAS組織GeMSU 56能力驗證)，CNAS T0659－23/79/104/175轉(zhuǎn)基因大豆粉(沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院組織的CNAS T0659能力驗證)，3%Bt11、5%MON810、10%MON863 轉(zhuǎn)基因玉米標(biāo)準(zhǔn)品和10%Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因棉花標(biāo)準(zhǔn)品:深圳安萊爾科技公司。

轉(zhuǎn)基因陰性樣品:CNAS T025－30非轉(zhuǎn)基因大豆粉(遼寧出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心組織的PTC－T025能力驗證)、CNAS T0659－74非轉(zhuǎn)基因大豆粉(沈陽產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院組織的CNAS T0659能力驗證)。經(jīng)驗證為轉(zhuǎn)基因陰性的9份豆腐、5袋豆奶粉、9袋豆奶、9份素雞、1份腐乳、1瓶大豆蛋白粉樣品均購于杭州市農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試劑與設(shè)備

基因組DNA提取試劑盒(Koning)和AceTaq?DNA聚合酶(Vazyme)分別購自于杭州百邁生物股份有限公司和南京諾唯贊生物科技公司;探針與引物委托美國Invitrogen公司合成;ABI7500實時熒光定量PCR儀;ND2000C核酸蛋白分析儀。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA的提取

稱取干重樣品(如豆奶粉)40 mg或濕重樣品(如豆腐、素雞、腐乳)150 mg，豆奶取1 mL離心后留沉淀物，按照Qiagen(69104)植物DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。大豆蛋白粉使用德國Congen Sure－Food PREP Plant X(S1006)進(jìn)行提取，加入50 μL滅菌雙重蒸餾水洗脫2次。用核酸蛋白分析儀檢測DNA提取的純度和濃度并計算拷貝數(shù)。

1.3.2 引物和探針設(shè)計

通過上海交通大學(xué)的轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫(http://ncmcg.sjtu.edu.cn) 等轉(zhuǎn)基因數(shù)據(jù)庫(http://www.cera－gmc.org)，比較分析商品化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因大豆外源基因信息。比較分析發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)基因大豆品種大多采用CaMV35S啟動子和nos終止子為調(diào)控元件。選定常用的CaMV35S和nos為靶標(biāo)外源基因。在NCBI網(wǎng)頁檢索大豆單拷貝內(nèi)源基因Lectin序列和CaMV35S啟動子和nos終止子，使用Primer Express 3.0軟件設(shè)計多重引物和熒光探針。探針分別使用熒光基團(tuán)VIC、FAM和Cy5作為發(fā)光基團(tuán)，使用BHQ和MGB作為非熒光淬滅基團(tuán)。在DNAstar軟件上評價引物和探針的特異性，在 BLAST 網(wǎng)頁(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上比對擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

1.3.3 單重?zé)晒釶CR反應(yīng)

在200 μL光學(xué)PCR反應(yīng)管中依次加入:滅菌蒸餾水14.75 μL、10 ×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP(10 mmol/L each)0.5 μL、引物(10 μmol/L)0.4 μL、探針(10 μmol/L)0.2 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.25 μL 和DNA模板1 μL，反應(yīng)混合液在實時熒光PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件設(shè)置為95℃預(yù)變性15 s;95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，進(jìn)行40個循環(huán)。定量中設(shè)置重復(fù)實驗和陰性對照實驗，陰性對照中不加模板DNA，而以滅菌蒸餾水代替，用于檢驗是否存在PCR污染和較高的引物二聚體污染。

1.3.4 多重?zé)晒釶CR反應(yīng)

20 μL多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系中包括3組檢測引物和探針，Taq酶，dNTP，基因組DNA等成分(具體見表1)，熒光定量PCR擴(kuò)增條件同1.3.3。設(shè)置三個復(fù)孔的重復(fù)和非模板空白對照。實驗結(jié)果應(yīng)用ABI 7500 software v2.3進(jìn)行分析處理。

表1 多重?zé)晒舛縋CR的反應(yīng)混合液組成

1.3.5 重復(fù)性和特異性檢測

提取CNAS T0659－104轉(zhuǎn)基因大豆樣本以及CNAS T0659－74非轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA，使用上述多重?zé)晒舛縋CR體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，驗證方法的特異性。

1.3.6 靈敏性檢測

提取10%Roundup Ready轉(zhuǎn)基因大豆樣本基因組DNA，按照10倍濃度稀釋5個梯度，稀釋介質(zhì)為基因組DNA提取時所用的洗脫液。根據(jù)大豆的單倍體基因組分子質(zhì)量約為1.15×10－12g。稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品每個反應(yīng)分別為 24 000、2 400、240、24、2.4拷貝。對5個梯度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實時熒光定量反應(yīng)，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，驗證方法的靈敏性。以拷貝數(shù)的自然對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)做內(nèi)源基因Lectin和外源基因CaMV35S和nos的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 樣本檢測

采用大豆轉(zhuǎn)基因成分多重?zé)晒舛縋CR檢測方法分別對大豆深加工產(chǎn)品和市場上購買的流通產(chǎn)品進(jìn)行檢測。同時對實驗室收集的轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花等轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品，以及中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)組織的能力驗證樣品進(jìn)行檢測，驗證方法的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA提取結(jié)果

按1.3.1方法提取的基因組DNA 260/280 nm OD 比值大多為1.7～1.9，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，完整性好，經(jīng)測試其含量為190～220 ng/L，純度良好，統(tǒng)一稀釋成100 ng/L，可滿足后續(xù)實驗要求。

2.2 引物和探針特異性檢測

按照1.3.2中的方法針對轉(zhuǎn)基因大豆常用的CaMV35S啟動子和nos終止子、內(nèi)源基因Lectin各設(shè)計2－3對引物和探針，然后測試引物和探針擴(kuò)增情況，選出特異性好的引物和探針用于后續(xù)實驗。篩選的引物和探針信息見表2。

表2 轉(zhuǎn)基因大豆特異性檢測的引物和探針序列

2.3 特異性檢測結(jié)果

圖1 不同基因多重?zé)晒釶CR反應(yīng)的擴(kuò)增曲線圖

提取轉(zhuǎn)基因大豆CNAS T0659－104和非轉(zhuǎn)基因大豆CNAS T0659－74樣本基因組DNA，使用上述多重?zé)晒舛縋CR體系進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分檢測，驗證方法的特異性。圖1為轉(zhuǎn)基因大豆CNAS T0659－104和非轉(zhuǎn)基因大豆CNAS T0659－74多重反應(yīng)的結(jié)果，內(nèi)源基因Lectin均產(chǎn)生了明顯的S型擴(kuò)增曲線，Ct值小于臨界值。外源基因CaMV35S和nos在轉(zhuǎn)基因大豆中檢出，且擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)明顯的S型，而非轉(zhuǎn)基因大豆中不檢出，空白對照無信號，檢測基因之間無信號干擾，外源基因的反應(yīng)結(jié)果與期望結(jié)果一致，表明引物探針的設(shè)計及反應(yīng)體系的設(shè)置具有特異性，可用于大豆轉(zhuǎn)基因成分的篩查檢測。

2.4 重復(fù)性和靈敏性檢測

圖2 不同基因多重?zé)晒釶CR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

由梯度稀釋的DNA擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，得出 R2為0.992 ～0.996。對 Ct值統(tǒng)計分析(表 3)，同一參照樣品重復(fù)間Ct值變異較小，Lectin基因Ct值變化范圍在 19.00～32.90之間，標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.066 ～0.477，R2為0.993，擴(kuò)增效率為 101%;外源基因CaMV35S的 Ct值變化范圍在21.57～36.89，標(biāo)準(zhǔn)偏差在 0.237 ～0.547，R2為 0.992，擴(kuò)增效率為91%;外源基因nos的 Ct值變化范圍在23.76～38.78，標(biāo)準(zhǔn)偏差在 0.065 ～0.510，R2為 0.996，擴(kuò)增效率為96%，表明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，使用該多重?zé)晒舛縋CR檢測大豆轉(zhuǎn)基因成分的最低檢測限為每20 μL反應(yīng)2.4個拷貝，最低定量限為每20 μL反應(yīng)24個拷貝。

2.5 樣品檢測結(jié)果

對市場上購買的流通產(chǎn)品共34個批次進(jìn)行檢測。同時對實驗室收集的轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花等轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)品，以及中國合格評定國家認(rèn)可委員會(CNAS)和英國FAPAS分析實驗室組織的能力驗證樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果見表4。同時按照標(biāo)準(zhǔn)SN/T 1204—2003中所述的引物和探針以及熒光定量PCR方法對上述檢測結(jié)果進(jìn)行驗證［16］，結(jié)果多重?zé)晒釶CR方法與標(biāo)準(zhǔn)確定的方法的檢測結(jié)果一致，表明本實驗研究開發(fā)的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系對大豆轉(zhuǎn)基因成分篩查檢測的適用性較高，可用于大豆及其深加工制品的轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測。

表3 轉(zhuǎn)基因大豆多重?zé)晒舛縋CR靈敏性檢測Ct值分析表

表4 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)對轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花標(biāo)準(zhǔn)品和CNAS/FAPAS能力驗證樣品的篩查檢測結(jié)果

3 討論

設(shè)計多重?zé)晒釶CR的熒光探針最好為同一類型:如同時為Taqman探針或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。但目前商品化的VIC和NED熒光探針僅以MGB標(biāo)記，故本實驗使用了兩條Taqman探針和一條MGB探針。MGB探針較短(14～20 bp)，容易找到所有排序序列的較短片段的保守區(qū)，而且加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)到熒光探針Tm值的要求。

由于目前不同熒光定量PCR儀的原理和提供的檢測光譜范圍的差異，因此在選擇探針的發(fā)光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)時要在所用儀器型號設(shè)置的熒光信號范圍內(nèi)選擇，本實驗使用ABI 7500熒光定量PCR儀，共設(shè)置5個檢測通道，有五色光源濾光片結(jié)合熒光濾光片組成的濾光系統(tǒng)。本實驗根據(jù)發(fā)射光譜范圍選擇 FAM(522 nm)標(biāo)記 CaMV35S，VIC(553 nm)標(biāo)記 Lectin，Cy5(666 nm)標(biāo)記 nos，3’端以BHQ或MGB為非熒光淬滅標(biāo)記。

為了能夠在同一反應(yīng)管中檢測3個靶標(biāo)基因，并保持較高的反應(yīng)效率，需對反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化。主要優(yōu)化的參數(shù)有退火溫度、引物和探針濃度、模板濃度以及擴(kuò)增試劑的用量等，通過退火溫度梯度實驗，確定了該多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)的最佳退火溫度為60℃，通過十字交叉法和熒光標(biāo)記的強(qiáng)弱與熒光信號之間的關(guān)系進(jìn)行了引物和探針濃度優(yōu)化，最終確定了最佳引物和探針濃度。

多重?zé)晒舛縋CR法融合了PCR的靈敏性和光譜技術(shù)定量精確的優(yōu)點，特異性強(qiáng)、敏感度高，操作方便、快速，整個擴(kuò)增和產(chǎn)物分析過程均在密封單管內(nèi)完成。不需電泳和紫外或染色觀察，并通過微機(jī)控制，實現(xiàn)了對 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實時動態(tài)檢測和自動分析結(jié)果。不需要對陽性對照、陰性對照、空白對照和待檢樣本分別進(jìn)行內(nèi)外源基因反應(yīng)管的檢測，可實現(xiàn)一管多檢，提高了檢測的通量性和可操作性。為確保該方法相對于實時熒光PCR，LAMP檢測方法和普通定性PCR檢測方法有較大優(yōu)越性，各方法對比分析如表5所示。

本實驗建立的多重?zé)晒釶CR技術(shù)可同時對CaMV35S和nos兩個外源基因進(jìn)行檢測，為保證方法的準(zhǔn)確性，通過了特異性、重復(fù)性和靈敏性的驗證，確保了該方法在同時檢測兩個靶標(biāo)基因時，無熒光信號的相互干擾，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;多重擴(kuò)增體系中設(shè)置了內(nèi)源基因的檢測，可以判斷核酸提取和擴(kuò)增反應(yīng)的有效性，避免出現(xiàn)假陰性反應(yīng)結(jié)果。

表5 多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)、實時熒光PCR技術(shù)，LAMP檢測方法和普通定性PCR檢測方法的對比分析

4 結(jié)論

通過對比優(yōu)化實驗，摸索出多重?zé)晒舛縋CR檢測的最佳反應(yīng)體系:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火并延伸1 min，40個循環(huán)，擴(kuò)增效率在90%～110%之間。通過梯度標(biāo)準(zhǔn)品稀釋建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2≥0.98，確定了最低檢測限為每20 μL反應(yīng)2.4個拷貝，最低定量限為每20 μL 反應(yīng)24個拷貝。該多重?zé)晒釶CR技術(shù)可以實現(xiàn)一管多檢的實際需要，降低試劑成本，縮短檢測時間，為大豆及其深加工產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測提供了有效方法，為促進(jìn)農(nóng)產(chǎn)品和食品出口提供技術(shù)保障。