許曉平，劉 成，張建平，羅建民，馬 光，程競(jìng)儀，章英劍

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)影像研究中心，上海 200032；3.上海分子影像探針工程技術(shù)中心，上海 200032；4.上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 201315；5.核物理與離子束應(yīng)用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

CD147分子是一種免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily）的跨膜糖蛋白，又被稱(chēng)為細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）誘導(dǎo)因子。已有研究表明，CD147分子廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面，并可能改變腫瘤生長(zhǎng)微環(huán)境，刺激成纖維細(xì)胞分泌MMP，引起細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1-2］。因此，CD147是一個(gè)極具吸引力的腫瘤診斷和治療的潛在靶點(diǎn)。

美妥昔單抗是一種特異性靶向CD147分子的單克隆抗體，其與放射性核素131I偶聯(lián)形成的利卡汀（licartin）已被中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)上市，用于肝癌的治療，對(duì)中晚期肝癌和預(yù)防肝癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)表現(xiàn)出良好的干預(yù)效果［3-5］。鑒于CD147廣泛高表達(dá)于多種腫瘤，美妥昔單抗是否可以進(jìn)一步應(yīng)用于其他腫瘤的診療，到目前為止尚未見(jiàn)公開(kāi)報(bào)道。本研究以125I標(biāo)記美妥昔單抗，利用小動(dòng)物SPECT/CT在活體動(dòng)物中持續(xù)觀(guān)察美妥昔單抗在荷人胰腺癌、肺癌腫瘤模型中的攝取變化，以初步評(píng)估美妥昔單抗用于肝癌以外其他腫瘤診斷和治療的可行性。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

美妥昔單抗HAb18F(ab’)2由空軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物工程研究中心提供，N-溴代丁二酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）購(gòu)自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）購(gòu)自荷蘭Nordic Immunology公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碘化鉀及丙酮購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海）；RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素-鏈霉素）、0.25%胰酶購(gòu)自法國(guó)Biowest公司；Na125I溶液購(gòu)自上海欣科醫(yī)藥有限公司。

雌性BALB/c裸小鼠，3只，18～20 g，無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，于復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心二、三級(jí)清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)；人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人胰腺癌細(xì)胞SW1990和人肺癌細(xì)胞A549由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

小動(dòng)物SPECT/CT購(gòu)自美國(guó)Bioscan公司；放射性薄層色譜儀（Radio-TLC）購(gòu)自德國(guó)Raytest公司。

1.3 125I放射性標(biāo)記HAb18F（ab'）2

改進(jìn)參考文獻(xiàn)［6］的方法，將100 μL HAb18F(ab’)2（5 mg/mL溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶液）加入2 mCi Na125I溶液，再加入20 μL NBS（1 mg/mL溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液），室溫下反應(yīng)1 min，最后加入100 μL HSA（10 mg/mL溶于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液）終止反應(yīng)。使用Radio-TLC分析125I-HAb18F(ab’)2的放射化學(xué)純度。

1.4 腫瘤模型建立

將SMMC-7721、SW1990和A549細(xì)胞系傳代后接種于50 cm2培養(yǎng)瓶中，加入RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，使用0.25%胰酶消化，傳代擴(kuò)增至所需用量，在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，至細(xì)胞總數(shù)為5×107個(gè)，收集細(xì)胞，用50%的基質(zhì)膠制成密度為1×107/mL的單細(xì)胞懸液，取0.2 mL快速皮下接種于BALB/c裸小鼠四肢。將肝癌細(xì)胞系SMMC-7721作為對(duì)照接種于右上肢，胰癌細(xì)胞系SW1990接種于左上肢，肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549接種于左下肢。裸小鼠在復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心培養(yǎng)4～6周，待實(shí)體瘤長(zhǎng)至7～8 mm時(shí)用于顯像。

1.5 小動(dòng)物顯像實(shí)驗(yàn)

顯像前3 d，荷瘤小鼠飲用水中加入碘化鉀以封閉甲狀腺。其中1只作為對(duì)照觀(guān)察，1只尾靜脈注射約1 mCi/100 μL的125I-HAb18F(ab’)2，另1只尾靜脈注射相同劑量的125I-納米-HAb18F(ab’)2，均于第1、4 h，以及第1、2、3、6、9天時(shí)進(jìn)行SPECT/CT顯像。顯像時(shí)以1.5%異氟烷/氧氣將小鼠麻醉、固定，數(shù)據(jù)重建后利用儀器配置的InVivo Scope軟件勾畫(huà)感興趣區(qū)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算腫瘤/肌肉（tumor-to-muscle，T/M）比值，比較不同腫瘤對(duì)125I-HAb18F(ab’)2的攝取情況。

2 結(jié) 果

2.1 125I-HAb18F(ab’)2質(zhì)量分析

標(biāo)記結(jié)束后，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于GF254硅膠板上，用丙酮展開(kāi)，經(jīng)Radio-TLC測(cè)定，125I-HAb18F(ab’)2的標(biāo)記率和放射化學(xué)純度均大于99%。其Radio-TLC譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 125I-HAb18F(ab’)2標(biāo)記液Radio-TLC譜圖

2.2 小動(dòng)物SPECT/CT顯像研究

為減少個(gè)體差異，本研究于同一只BALB/c裸小鼠接種3種腫瘤，包括肝癌、胰腺癌和肺癌細(xì)胞系，以評(píng)估125I-HAb18F(ab’)2在不同腫瘤模型中的分布和腫瘤攝取情況。尾靜脈注射125I-HAb18F(ab’)2后不同時(shí)間點(diǎn)歸一化后的腫瘤SPECT/CT顯像見(jiàn)圖2，體內(nèi)放射性分布特點(diǎn)見(jiàn)圖3。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤125I-HAb18F(ab’)2的SPECT/CT成像

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)125I-HAb18F(ab’)2在荷瘤小鼠體內(nèi)放射性分布

圖2清晰呈現(xiàn)了125I-HAb18F(ab’)2大分子單抗體內(nèi)清除慢的特點(diǎn)，尾靜脈注射1 h后主要分布于血液中，心臟呈現(xiàn)高度放射性濃集，腫瘤未見(jiàn)明顯放射性攝取。注射4 h后，125I-HAb18F(ab’)2在血液中的分布仍然處于高水平，但較1 h時(shí)已有明顯下降，同時(shí)放射性開(kāi)始濃集于腫瘤部位。注射1 d后，125I-HAb18F(ab’)2在血液中還有部分殘留，未清除干凈，但3種腫瘤均已呈現(xiàn)出異常高的放射性攝取，并遠(yuǎn)高于血液中的放射性。注射2 d后，125I-HAb18F(ab’)2只濃集于3個(gè)腫瘤部位，全身其余部位放射性接近本底。注射3 d后，3種腫瘤對(duì)125I-HAb18F(ab’)2的攝取發(fā)生改變，肺癌A549病灶的放射性攝取開(kāi)始降低、注射9 d時(shí)已無(wú)明顯放射性分布；胰癌SW1990病灶則與肝癌SMMC-7221一樣，雖有下降，但在注射后第9天仍有明顯攝取。圖3可見(jiàn)放射性主要經(jīng)泌尿道排泄，胃腸有極少量的放射性分布，甲狀腺封閉良好，未見(jiàn)放射性碘積聚。

利用儀器自帶的InVivo Scope軟件勾畫(huà)腫瘤以及右下肢肌肉為感興趣區(qū)，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)的T/M比值。結(jié)果顯示，胰腺癌SW1990和肝癌SMMC-7221的T/M比值均在注射125I-HAb18F(ab’)2后6 d左右達(dá)到峰值，分別高達(dá)234和432（圖4）；而肺癌A549的T/M比值則在注射3 d左右達(dá)到峰值（26）。

圖4 3種腫瘤不同顯像時(shí)間點(diǎn)T/M比值

3 討 論

CD147分子在許多實(shí)體腫瘤如肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及惡性黑素瘤中高表達(dá)［7］。CD147進(jìn)一步可與其效應(yīng)細(xì)胞（癌周成纖維細(xì)胞）相結(jié)合，誘導(dǎo)MMP產(chǎn)生，提高腫瘤組織中的MMP含量和活性，導(dǎo)致間質(zhì)成分和血管基底膜膠原蛋白過(guò)度降解，腫瘤細(xì)胞從而可以穿過(guò)基底膜和結(jié)締組織屏障不斷侵襲擴(kuò)散，與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［8-9］。因此，CD147可作為腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的潛在實(shí)用標(biāo)志物，為惡性腫瘤的診療提供一個(gè)新策略。

美妥昔單抗高度特異性靶向CD147分子，其與131I核素偶聯(lián)而成的利卡汀是全球第1個(gè)批準(zhǔn)上市的用于治療中晚期原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的放射免疫靶向藥物，在臨床應(yīng)用中取得了令人鼓舞的療效。然而，到目前為止臨床上該單抗的研究?jī)H限于肝癌，在其他腫瘤中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以肝癌為對(duì)照，探討美妥昔單抗是否可能用于其他腫瘤，采用小動(dòng)物SPECT/CT長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)可視化觀(guān)察其靶向胰腺癌和肺癌的能力，并利用設(shè)備自帶軟件對(duì)其進(jìn)行半定量分析。

基于125I化學(xué)性質(zhì)同131I，但物理半衰期遠(yuǎn)長(zhǎng)于131I，達(dá)60 d，其粒子植入局部控制腫瘤效果顯著，本研究選擇核素125I標(biāo)記美妥昔單抗以長(zhǎng)期觀(guān)察其靶向性和全身分布，其中標(biāo)記方法選擇氧化能力較為溫和的NBS方法，以避免氧化劑對(duì)單抗結(jié)構(gòu)的破壞，影響其生物學(xué)活性。結(jié)果顯示，該標(biāo)記方法十分有效，標(biāo)記率＞99%（優(yōu)于已有文獻(xiàn)報(bào)道［6，10］），因此125I-HAb18F(ab’)2無(wú)需純化，可以直接使用；此外，其生物活性良好（肝癌、胰癌模型中抗原-抗體結(jié)合能力達(dá)9 d以上），這對(duì)尋找亞臨床病灶有利，并會(huì)對(duì)原發(fā)灶和播散轉(zhuǎn)移灶均產(chǎn)生持續(xù)的內(nèi)照射治療，同時(shí)因射程有限，血液、骨髓等非靶器官分布和腸道內(nèi)脫落碘極低，不會(huì)產(chǎn)生明顯的不良反應(yīng)；最后，還有利于HAb18F(ab’)2的推廣應(yīng)用。

采用氧化法標(biāo)記的碘標(biāo)志物容易在體內(nèi)脫碘，因此本研究于顯像前3 d在顯像動(dòng)物的飲用水中加入1%碘化鉀以封閉甲狀腺，以提高SPECT/CT影像質(zhì)量［11］。盡管HAb18F(ab’)2已經(jīng)是抗體片段，但是其相對(duì)分子質(zhì)量仍然達(dá)到97 000，顯像結(jié)果也清晰顯示這一點(diǎn)，1、4 h時(shí)放射性主要分布在血液中，心臟和主要血管均呈現(xiàn)高度放射性分布，1 d后血液中仍然殘留125I-HAb18F(ab’)2，可以較為清晰地分辨心臟和主動(dòng)脈，同時(shí)3種腫瘤都呈現(xiàn)出明顯放射性攝取，并且影像對(duì)比度高，完全滿(mǎn)足腫瘤診斷要求。125I-HAb18F(ab’)2在正常肝組織快速代謝，未見(jiàn)明顯放射性滯留，進(jìn)一步證明了利卡汀在肝癌治療中的應(yīng)用潛力。肺癌A549移植瘤的T/M比值在第3天（峰值26）后下降，說(shuō)明125I-HAb18F(ab’)2與A549腫瘤表面CD147分子的結(jié)合在3 d后開(kāi)始脫落（并非脫碘），第6天時(shí)A549瘤灶已無(wú)明顯放射性分布。胰腺癌與肝癌一樣，第6天后開(kāi)始脫落，但T/M比值高達(dá)234和432。本研究通過(guò)小動(dòng)物分子影像的臨床前研究初步探索了肝癌放射性藥品類(lèi)似物125I-HAb18F(ab’)2的質(zhì)量及其靶向胰腺癌、肺癌的能力，其在胰腺癌中高比度內(nèi)照射長(zhǎng)達(dá)9 d以上，提示可用于治療嘗試，以拓展美妥昔單抗的應(yīng)用。

致謝

衷心感謝空軍軍醫(yī)大學(xué)陳志南院士饋贈(zèng)美妥昔單抗HAb18F(ab’)2供本研究使用。