楊菁，張從利

(西電集團醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710077)

痛覺過敏是神經(jīng)病理性疼痛的疼痛表現(xiàn)，指對正常刺激的敏感性增加[1]。疼痛感對自我保護、危險識別和控制傷害的延長等至關(guān)重要。然而，組織損傷、慢性炎癥和神經(jīng)病理學(xué)均可誘導(dǎo)傷害性神經(jīng)元可塑性，從而導(dǎo)致病理性疼痛。最終，疼痛成為疾病本身，失去了維持身體完整性的保護特性[2]。坐骨神經(jīng)結(jié)扎導(dǎo)致的慢性壓迫性損傷已被廣泛用于研究神經(jīng)病理學(xué)疼痛的病理。因此，本研究采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic compression injury，CCI)作為實驗動物神經(jīng)性疼痛誘導(dǎo)模型[3]，檢測CCI術(shù)后大鼠的機械性痛覺過敏、冷觸誘發(fā)痛以及熱痛覺過敏隨時間的變化。目前，研究已經(jīng)確定了觸發(fā)神經(jīng)性疼痛發(fā)作的細胞和分子信號，但是慢性疼痛的自我修復(fù)機制在很大程度上還是未知的。研究[4]表明，突觸強度和功效的依賴性增加，最終導(dǎo)致神經(jīng)疼痛模型動物的慢性機械性觸誘發(fā)痛。此外，軸突運輸障礙可能導(dǎo)致軸突機械敏感性和機械超敏反應(yīng)[5]，此機制為疼痛的研究提供了新的思路。本研究主要從突觸可塑性以及軸突運輸兩方面探討CCI術(shù)后痛覺過敏的機制，探討CCI對神經(jīng)生長相關(guān)蛋白(GAP-43)、神經(jīng)纖維粘附分子(NCAM1)、突觸后致密蛋白(PSD-95)、突觸體素(Syp)、驅(qū)動蛋白(kinesin)以及動力蛋白(dynein)的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選用180～221 g成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。實驗動物在241 ℃的室溫下自由喂食和飲水，12/12光照/黑暗循環(huán)。將大鼠隨機分為兩組：Sham組(假手術(shù)組，n=20)，CCI組(坐骨神經(jīng)損傷組，n=20)。

1.2 建立坐骨神經(jīng)損傷模型

采用CCI誘導(dǎo)大鼠外周神經(jīng)性疼痛[3]。按體重對手術(shù)大鼠腹膜內(nèi)注射40 mg/kg的戊巴比妥鈉進行麻醉。在股肌肉下方做3～4 mm的深切，暴露坐骨神經(jīng)，并用無菌4-0腸線在4個連續(xù)位點進行松扎，間隔為1 mm。假手術(shù)組：只暴露坐骨神經(jīng)而不結(jié)扎。之后，兩組均立即絲線縫合肌肉和皮膚層，并應(yīng)用局部抗生素。所有外科手術(shù)均在無菌條件下進行。

1.3 疼痛超敏反應(yīng)檢測

分別在術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d及21 d對大鼠進行疼痛超敏反應(yīng)測試。

1.3.1 機械性痛覺過敏 采用von Frey細絲評估機械性痛覺過敏[6]。將大鼠放入高架金屬網(wǎng)底箱中，通過電子von Frey絲緩慢勻速向大鼠后肢足底表面施加壓力。記錄大鼠足退縮或后肢回縮時的壓力值，記為縮足反射閾值(PWT，g)。每組測量3次，間隔15 min，取3次平均值。

1.3.2 冷觸誘發(fā)痛 采用丙酮跌落試驗檢測冷觸誘發(fā)痛[7]。將大鼠放入高架金屬網(wǎng)底箱中，向大鼠后爪足底表面噴灑100 μL丙酮。記錄大鼠縮足持續(xù)時間(c-PWL，sec)。每組測量3次，間隔15 min，取3次的平均值。

1.3.3 熱痛覺過敏 采用Eddy’s熱板評估熱痛覺過敏[8]。保持溫度在(52.51.0)℃，記錄大鼠撤回后爪或舔爪的時間，記為后爪熱縮足反射閾值(h-PWL，sec)。為避免后爪受傷，設(shè)置15 s為截止時間。每組測量3次，間隔15 min，取3次的平均值。

1.4 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)分析

CCI后14 d，分別取兩組各10只大鼠同側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)(DRG)進行qRT-PCR分析。剩余大鼠繼續(xù)進行行為學(xué)檢測，CCI后21 d，取兩組各剩余的10只大鼠DRG進行qRT-PCR分析。用Trizol試劑(Invitrogen，USA)從DRG中分離總RNA。2 μg總RNA依照High-Capacity RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems，USA)合成cDNA。按照說明書，使用特異性引物、SYBR Green I 試劑和RT-PCR試劑盒，在Bio-Rad iQ5定量PCR系統(tǒng)(Takara，中國)上檢測mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平。相對表達水平通過2-DΔCt方法計算。采用內(nèi)參基因GAPDH定量靶基因。采用Primer-BLAST在線引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，引物設(shè)計見表1。

表1 引物設(shè)計

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CCI對痛覺過敏的影響

圖1A和圖1C顯示，術(shù)前1 d，兩組間PWT和h-PWL均無顯著差異。從術(shù)后1 d開始至術(shù)后14 d，CCI組大鼠的PWT和h-PWL均隨時間的增加而逐漸降低，且在每個時間點上與Sham組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CCI組大鼠的PWT和h-PWL在術(shù)后21 d均比術(shù)后14 d時增加。

圖1B顯示，術(shù)前1 d，兩組間c-PWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從術(shù)后1 d開始至術(shù)后14 d，CCI組大鼠的c-PWL隨時間的增加而逐漸增加，且在每個時間點上與Sham組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。CCI組大鼠的c-PWL在術(shù)后21 d均比術(shù)后14 d時降低。

2.2 CCI對突觸可塑性的影響

圖2A和圖2B顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中GAP-43和NCAM1的表達增加(P<0.01)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d相比，GAP-43和NCAM1的表達均下降(P<0.01,P<0.05)，但未恢復(fù)至正常水平。

圖2C和圖2D顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中PSD-95和Syp的表達均降低(P<0.05)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d相比，PSD-95和Syp的表達均增加(P<0.05)，但尚未恢復(fù)至正常水平。

2.3 CCI對軸突運輸?shù)挠绊?/h3>

圖3顯示，與Sham-14 d組相比，CCI術(shù)后14 d DRG中kinesin和dynein的表達均降低(P<0.05)。而術(shù)后21 d，與CCI-14 d對比，kinesin和dynein的表達增加(P<0.01)，且高于正常水平。

3 討論

本研究旨在從突觸可塑性和軸突運輸兩方面探討大鼠坐骨神經(jīng)CCI后的神經(jīng)機制。有研究[3]報道，CCI誘導(dǎo)的坐骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理學(xué)顯著改變，此作用在神經(jīng)損傷后約2周觀察到最大效應(yīng)。因此，本研究評價在CCI后21 d內(nèi)痛覺過敏指標，對冷觸誘發(fā)痛的檢測，噴灑丙酮后，大鼠的正常反應(yīng)是快速退回爪子，迅速放置在網(wǎng)絲上。而在神經(jīng)性疼痛大鼠中，其后爪縮回并放置在網(wǎng)絲上的持續(xù)時間較長，因此通過測量縮足持續(xù)時間(c-PWL，sec)評估后爪對丙酮的冷觸誘發(fā)痛。結(jié)果顯示，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d開始出現(xiàn)PWT和h-PWL隨時間的增加而逐漸降低，在術(shù)后14 d 時到達低谷，21 d時開始恢復(fù)。這表明坐骨神經(jīng)損傷后大鼠對機械性傷害的敏感程度增強，對熱刺激的耐受降低。坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d開始出現(xiàn)PWT和h-PWL隨時間的增加而逐漸降低，在術(shù)后14 d時到達低谷，21 d時開始恢復(fù)。c-PWL在坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1 d隨時間的增加而增加，在術(shù)后14 d時到達峰值，21 d時開始降低。這表明坐骨神經(jīng)損傷后大鼠對由冷刺激誘發(fā)的疼痛的維持時間增加。

研究表明，DRG可能是痛覺過敏狀態(tài)中受損的器官之一，且神經(jīng)損傷可以誘導(dǎo)DRG中基因和蛋白質(zhì)表達的改變，導(dǎo)致痛覺過敏的發(fā)展[9]。因此，本研究主要以DRG為研究對象，探討CCI后14 d和21 d DRG中突觸可塑性和軸突運輸指標的變化。

神經(jīng)生長相關(guān)蛋白GAP-43是主要存在于神經(jīng)生長錐和突觸前末梢的一種細胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白。蛋白激酶C可以磷酸化GAP-43的絲氨酸41(Ser41)位點，磷酸化的GAP-43通過穩(wěn)定肌動蛋白微絲調(diào)節(jié)神經(jīng)生長、出芽以及突觸重塑[10]。研究[11]表明，GAP-43 mRNA的表達在舌下神經(jīng)橫斷后2周內(nèi)達到最高峰值，然后逐漸降低。這與本研究結(jié)果一致，在CCI后14 d GAP-43 mRNA的表達顯著增加，而CCI后21 d顯著降低，表明CCI 2周后，機體的損傷修復(fù)基本完成。神經(jīng)纖維粘附分子NCAM1是調(diào)節(jié)突觸發(fā)生、神經(jīng)突生長、細胞間相互作用和突觸可塑性的蛋白質(zhì)[12]。研究表明，NCAM1參與周圍神經(jīng)損傷誘導(dǎo)激活前扣帶皮層對特定突觸蛋白翻轉(zhuǎn)的持續(xù)增強這一過程，且NCAM1介導(dǎo)脊柱重組，有助于行為敏化。周圍神經(jīng)結(jié)扎后，突觸后密度部分的NCAM1水平顯著增強[13]。本研究顯示，在CCI后14 d NCAM1 mRNA的表達顯著增加，而此時痛覺過敏癥狀亦最為顯著，而CCI后21 d NCAM1 mRNA表達顯著降低。

突觸可塑性的中心為興奮性突觸，而興奮性突觸的突觸后位點是由突觸后致密蛋白(PSD)附著于突觸后膜上形成的[14-15]。研究[16]表明，海馬神經(jīng)元中PSD-95的過表達可促進突觸成熟，特別是谷氨酸能突觸的成熟。本研究顯示，在CCI后14 d PSD-95 mRNA的表達顯著降低，表明由于坐骨神經(jīng)的損傷，在損傷后14 d只有少量PSD-95附著于突觸后膜，傳遞興奮。而CCI后21 d PSD-95 mRNA表達顯著增加，提示神經(jīng)損傷修復(fù)增加，大量PSD-95附著于突觸后膜，形成興奮性突觸的突觸后位點，傳遞興奮。Syp是一種鈣結(jié)合糖蛋白，作為含有神經(jīng)遞質(zhì)的突觸前小泡的整體跨膜蛋白組分被發(fā)現(xiàn)[17]，其主要參與突觸小泡融合和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程，已被廣泛認為是突觸密度的標記[18]。研究[19]表明，在坐骨神經(jīng)CCI后，Syp蛋白的表達峰值出現(xiàn)在損傷后14 d，有趣的是，本研究結(jié)果顯示，CCI后14 d Syp mRNA的表達顯著降低，而CCI后21 d顯著增加，表明CCI 14 d內(nèi)突觸小泡的融合以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等神經(jīng)信息傳遞過程受到損傷，而14 d后，此過程逐漸恢復(fù)。因此，關(guān)于CCI后Syp表達隨時間的變化，還有待進一步詳細研究。

軸漿運輸?shù)陌l(fā)生有賴于馬達蛋白中的驅(qū)動蛋白(kinesin)和動力蛋白(dynein)水解ATP所產(chǎn)生的能量[20]。Kinesin將營養(yǎng)物質(zhì)和dynein從胞體運輸?shù)绞軗p的軸突遠端(順向流動)，dynein到達軸突遠端后，再直接或者間接和營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合，將營養(yǎng)物質(zhì)運輸至胞體(逆向流動)[21]。本研究結(jié)果顯示，CCI后14 d kinesin和dynein mRNA的表達顯著降低，表明在坐骨神經(jīng)損傷后14 d內(nèi)，軸突運輸發(fā)生障礙。在CCI 14 d內(nèi)，由于神經(jīng)生長相關(guān)的蛋白如GAP-43和NCAM1的增加，修復(fù)受損的神經(jīng)元，為軸突運輸和突觸傳遞提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但由于突觸小泡蛋白Syp以及突觸后膜致密部位蛋白PSD-95在CCI后14 d內(nèi)的降低，表明此時突觸后膜的結(jié)構(gòu)還不夠完善，突觸小泡的融合以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放還存在障礙，導(dǎo)致不能傳遞興奮。這些可能是由于此時kinesin和dynein蛋白表達降低，沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，因此不足以維持神經(jīng)元重塑的能量消耗。而CCI后21 d kinesin和dynein mRNA表達增加，同時Syp和PSD-95的表達亦增加，表明該時神經(jīng)元重塑已啟動，而神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的修復(fù)已接近尾聲，因此GAP-43和NCAM1的表達降低。

總之，本研究表明CCI后14 d，大鼠的機械性痛覺過敏、冷觸誘發(fā)痛以及熱痛覺過敏達到最大效應(yīng)，14 d后開始緩解。GAP-43和NCAM1在CCI后14 d內(nèi)顯著增加，損傷14 d后降低，而Syp、PSD-95、kinesin和dynein在CCI后14 d內(nèi)顯著降低，損傷14 d后增加。這提示坐骨神經(jīng)損傷14 d內(nèi)，主要以修復(fù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)為主。而損傷14 d后，突觸小泡的融合、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、興奮的傳遞以及軸突運輸啟動，而此時神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的修復(fù)已接近尾聲。