蹇順海，陳筱莉，何琳莉，王莉，黃一凡，殷秀，文彬

(川北醫(yī)學(xué)院，1.病理學(xué)教研室；2.病理生理教研室，四川 南充 637000)

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，高發(fā)地區(qū)發(fā)病率約為0.05%，鱗狀細(xì)胞癌占90%。食管癌的發(fā)生是多基因、多途徑改變的結(jié)果，尋找敏感的分子標(biāo)記，用于食管癌早期診斷，治療和判斷預(yù)后具有重要意義。Wnt誘導(dǎo)的分泌型蛋白1(Wnt-induced secreted protein-1，WISP-1))屬于CCN( cysteine rich 61/connective tissue growth factor/nephmblastoma overexpressed gene ) 家族的成員，在乳腺癌[1-2]、直腸癌[3]、腺樣囊性癌[4]等多種腫瘤中高表達(dá)，也是wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要靶基因。細(xì)胞黏附分子L1(The L1 cell adhesion molecule，L1CAM)作為一種神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，對(duì)神經(jīng)組織的發(fā)育與遷移起重要作用，在結(jié)腸癌，卵巢癌，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中有較高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，L1分子是β-catenin/TCF信號(hào)通路的靶基因。本研究通過免疫組化方法，以癌旁相對(duì)正常組織，食管癌組織為研究對(duì)象，檢測(cè)WISP-1，β-catenin，L1CAM在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，探討其與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2008年6月至2009年6月食管癌根治術(shù)標(biāo)本60例。全部臨床病理資料收集完整，術(shù)前活檢證實(shí)為食管鱗狀細(xì)胞癌，未行放、化療治療，術(shù)后標(biāo)本完整。本組患者發(fā)病年齡40～77歲，中位年齡61.5歲，平均年齡60.4歲。男性39例，女性21例。另取57例癌旁(距癌灶3 cm，形態(tài)學(xué)無不典型增生)正常食管上皮作對(duì)照。

1.2 主要試劑

WISP-1及L1CAM均購(gòu)自abcam公司，WISP-1系兔抗人多克隆抗體，稀釋比例1∶200；L1CAM為鼠抗人單克隆抗體，稀釋比例1∶100；β-catenin購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，稀釋比例1∶100。

1.3 免疫組化染色

石蠟組織連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟后水化，En vision兩步法，DAB顯色在光鏡下嚴(yán)格控制顯色反應(yīng)。結(jié)果均以已知陽(yáng)性標(biāo)本為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或褐黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，染色背景清晰，WISP-1定位于細(xì)胞質(zhì)和包膜；L1CAM定位于細(xì)胞膜。根據(jù)半定量方法劃分著色強(qiáng)度：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%為(3+)，20%～50%為(2+)，5%～20%為(1+)， <5%或不著色為(0)，前兩者為陽(yáng)性表達(dá)，后兩者記為陰性表達(dá)。β-catenin彌漫表達(dá)于正常鱗狀上皮細(xì)胞胞膜，在癌細(xì)胞中，細(xì)胞膜不表達(dá)或低于70%的細(xì)胞膜陽(yáng)性，定義為細(xì)胞膜表達(dá)缺失；當(dāng)>10%癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)時(shí)，為異位表達(dá)，定義為過表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，3種蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

本組病例中，位于食管上段3例，中段36例，下段16例，同時(shí)累及食管中上段2例，中下段3例。按組織學(xué)分級(jí)，高分化25例，中分化29例，低分化6例。浸潤(rùn)黏膜固有層、或黏膜肌及粘膜下層共9例，浸潤(rùn)固有肌層23例，侵及外膜28例，。依據(jù)AJCC第7版食管癌的臨床病理分期，Ⅰa期6例，Ⅰb期6例，Ⅱa期14例，Ⅱb期 17例，Ⅲa期7例，Ⅲb期6例，Ⅲc 期3 例，Ⅳ期1例(肝轉(zhuǎn)移)。為便于分析，將Ⅰa期，Ⅰb合并為Ⅰ期，Ⅱa、b、c期合并為Ⅱ期，Ⅲ～Ⅳ期合并為晚期組。

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 食管癌組織中WISP-1，β-catenin與L1CAM的表達(dá) 60例食管鱗狀細(xì)胞癌中WISP-1(圖1)、β-catenin(圖2)、L1CAM(圖3)的陽(yáng)性表達(dá)率或異常表達(dá)率分別為66.7%、100%和43.3%，其在癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率分別為9.6%、0和3.6%。3種蛋白在癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。

表1 食管鱗癌組織與癌旁組織WISP-1、L1CAM表達(dá)情況比較

2.2.2 WISP-1，β-catenin與L1CAM的表達(dá)與食管癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 WISP-1的表達(dá)與性別、浸潤(rùn)深度、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與腫瘤分化程度有關(guān)，高分化鱗癌表達(dá)比率和強(qiáng)度高于低分化癌。β-catenin表達(dá)與性別、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不相關(guān)，與腫瘤分期相關(guān)，分期越高，表達(dá)缺失越多。L1CAM的表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期有關(guān)，與性別無明顯相關(guān)性(表2)。

2.2.3 WISP-1，L1CAM與β-catenin在食管癌中表達(dá)的相互關(guān)系 食管鱗癌中WISP-1的表達(dá)與β-catenin異常表達(dá)無相關(guān)性。L1CAM與β-catenin異常表達(dá)有顯著相關(guān)性，β-catenin腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和核陽(yáng)性者，前者的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和比例增高(r=-0.495，P<0.001)。見表3。

3 討論

WISP-1基因定位于8q24.1～8q24.3，編碼產(chǎn)物含367個(gè)氨基酸，含有4個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。研究表明，WISP-1通過激活抗凋亡蛋白激酶B(Akt)信號(hào)途徑，抑制細(xì)胞色素C釋放，上調(diào)抗凋亡蛋白BCL-XL，封閉P53下游蛋白，從而阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[5]。

本組病例中，WISP-1在食管鱗癌中的陽(yáng)性率為66.7%，顯著高于癌旁組織。Nagai等[6]檢測(cè)了105例食管鱗癌WISP-1的表達(dá)情況，陽(yáng)性表達(dá)率為56%，兩者陽(yáng)性結(jié)果比較一致。Nagai等發(fā)現(xiàn)WISP-1的表達(dá)與食管癌的浸潤(rùn)深度、病變大小，腫瘤生長(zhǎng)方式、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。但本組結(jié)果僅顯示與食管癌的分化程度有關(guān)，可能與存在樣本偏差、樣本含量較少有關(guān)。本組病例中WISP-1在原位癌區(qū)域的表達(dá)強(qiáng)度也明顯高于癌旁組織。新近的研究顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌WISP-1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織并且其表達(dá)強(qiáng)度與低生存率相關(guān)。敲除口腔鱗狀細(xì)胞癌1483細(xì)胞株的WISP-1可以顯著降低細(xì)胞的侵襲能力并誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[7]。另有研究表明WISP-1可以通過反式激活EGFR/ERK/HIF-1-α通路，促進(jìn)VEGF-A表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成[8]；通過調(diào)節(jié)VEGF-C的表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴管生成，利于腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。這些研究結(jié)果提示W(wǎng)ISP-1過表達(dá)在食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中起了非常重要的作用。WISP-1可作為判斷腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物之一。

L1CAM基因定位于Xq28，全長(zhǎng)25kb，含28個(gè)外顯子，編碼產(chǎn)物為200～220 KDa跨膜糖蛋白。L1CAM表達(dá)于正常神經(jīng)上皮，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。正常粘膜上皮一般不表達(dá)，在胃黏膜可呈弱表達(dá)，在胃癌[10]、膽管細(xì)胞癌[11]等惡性腫瘤中呈強(qiáng)表達(dá)。本組研究結(jié)果顯示L1在食管鱗癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為43.3%，且陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床病理分期密切相關(guān)。Guo等[12]發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌(N=157)L1CAM的表達(dá)顯著高于正常組織，且與總生存率降低顯著有關(guān)。進(jìn)一步研究表明，L1CAM通過活化整合素β1/MAPK/ERK/AP1信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞骨架蛋白ezrin表達(dá)，ezrin蛋白參與細(xì)胞微絨毛的組成，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)黏附和腫瘤轉(zhuǎn)移有重要作用。Hung等[13]發(fā)現(xiàn)L1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)，通過短發(fā)夾shRNA干擾L1CAM基因的的表達(dá)，可以顯著減少癌細(xì)胞增殖，同時(shí)降低癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Xu等[14]通過對(duì)中國(guó)人食管癌患者191例(正常對(duì)照組94例)血液循環(huán)L1CAM自身抗體的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)食管癌人群L1CAM自身抗體水平明顯高于對(duì)照組，敏感性為27.7%，特異性為91.5%，結(jié)果提示血液中L1CAM自身抗體可以作為早期發(fā)現(xiàn)食管鱗狀細(xì)胞癌潛在的生物標(biāo)志物。

β-catenin不僅是E-cadherin/catenin復(fù)合物的重要組成部分，還是wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵成分，前者主要作用在于參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)之間的粘附，后者參與多種腫瘤的發(fā)生。結(jié)腸家族性腺瘤性息肉蛋白(APC)基因的失活、β-catenin 基因突變、或者Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，均可以導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)、胞核內(nèi)異常集聚，穩(wěn)定性增加。細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin和DNA結(jié)合分子相互作用，激活下游基因如cyclin-D1、c-myc等，促使細(xì)胞分裂增殖，進(jìn)而形成腫瘤。

本組試驗(yàn)顯示β-catenin在食管癌的過表達(dá)率為28.3%，與劉莉等[15]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本研究還發(fā)現(xiàn)β-catenin表達(dá)與性別、分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素?zé)o關(guān)，而與腫瘤分期相關(guān)。Situ等[16]報(bào)道β-catenin的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤位置、大小、分化程度、浸潤(rùn)深度及AJCC臨床病理分期無相關(guān)性，但與患者預(yù)后有關(guān)，β-catenin過表達(dá)比表達(dá)缺失患者的生存時(shí)間短，相對(duì)于T2-3N0M0期，β-catenin表達(dá)增高是一個(gè)預(yù)后不良的獨(dú)立因素。然而有關(guān)食管癌β-catenin的表達(dá)文獻(xiàn)報(bào)道并不一致，也有研究認(rèn)為β-catenin表達(dá)降低或缺失與預(yù)后不良有相關(guān)性[17]，由于β-catenin對(duì)E-cadherin粘附功能的完整性是必須的，β-catenin表達(dá)減弱會(huì)降低細(xì)胞間的粘附性，致使腫瘤細(xì)胞分散，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，形成轉(zhuǎn)移。本組病例顯示β-catenin表達(dá)減弱或缺失多見于分化差的細(xì)胞，在Nozoe等[18]研究中，單因素分析發(fā)現(xiàn)食管鱗癌β-catenin低表達(dá)提示預(yù)后不良。綜上所述，β-catenin在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用十分復(fù)雜，表達(dá)下調(diào)或過表達(dá)均有助于食管鱗癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。不同的組織學(xué)類型、疾病發(fā)展不同階段等也許是β-catenin表達(dá)方式差異的原因，有必要在β-catenin基因水平進(jìn)一步研究。

本組結(jié)果顯示β-catenin過表達(dá)與L1CAM增強(qiáng)有關(guān)。Gavert等[19]研究發(fā)現(xiàn)，將含有2.9kb轉(zhuǎn)錄起始區(qū)上游基因L1啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，與穩(wěn)定突變的β-catenin共轉(zhuǎn)染進(jìn)結(jié)腸癌293細(xì)胞中，L1啟動(dòng)子活性增強(qiáng)6倍。Pfeifer等[20]在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，上調(diào)β-catenin可增強(qiáng)L1啟動(dòng)子活性。Kato等[21]研究認(rèn)為當(dāng)β-catenin在結(jié)腸癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核內(nèi)集聚，可使L1的DNA中心啟動(dòng)子及TCF結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生低甲基化，致使L1異常表達(dá)。但在食管鱗癌中是否如此尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

有研究將突變的β-catenin基因轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中，WISP-1啟動(dòng)基因被激活，激活程度還與轉(zhuǎn)染突變?chǔ)?catenin基因的數(shù)量有關(guān)系[22]，表明WISP-1是wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要靶基因。但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示食管癌中WISP-1和β-catenin的表達(dá)沒有相關(guān)性，提示W(wǎng)ISP-1可能存在其他激活途徑。

總之，食管癌的發(fā)生是多基因、多步驟改變的結(jié)果，分子機(jī)制復(fù)雜。我們研究顯示W(wǎng)ISP-1 、L1CAM蛋白在食管癌中過表達(dá)，以及β-catenin異常表達(dá)均與食管癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。WISP-1，β-catenin，L1CAM對(duì)預(yù)測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為有一定價(jià)值，可能會(huì)是食管癌治療潛在的新靶點(diǎn)。然而，對(duì)食管癌中這三種蛋白的相互作用和分子機(jī)制進(jìn)行更加深入地研究仍有必要。