李 帆,羅行煒,劉建華,梁 軍,賀丹丹,潘玉善,苑 麗,胡功政*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.河南省鄭州市獸藥飼料監(jiān)察所,河南 鄭州 450000)

0 引言

沙門氏菌是一種人獸共患病原菌,分布廣,危害大,該菌也是世界各地人類食物中毒的主要致病菌,因此,沙門氏菌的多重耐藥性對(duì)動(dòng)物與人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。細(xì)菌耐藥性可通過(guò)外排泵等多種耐藥機(jī)制產(chǎn)生[1]。2003年,1個(gè)新的耐藥結(jié)節(jié)分化(RND)家族多藥外排泵oqxAB由丹麥科學(xué)家Sorensen等[2]在大腸桿菌接合性質(zhì)粒pOLA52上發(fā)現(xiàn),是首先發(fā)現(xiàn)的對(duì)喹乙醇耐藥的分子機(jī)制[3],現(xiàn)已被確定為質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類的耐藥機(jī)制(PMQR)之一[4]。oqxAB由基因oqxA和oqxB組成,不僅介導(dǎo)對(duì)喹噁啉類藥物(喹乙醇、痢菌凈)、氯霉素的耐藥性,而且還可降低細(xì)菌對(duì)氟苯尼考、喹諾酮類(環(huán)丙沙星、恩諾沙星和諾氟沙星)、TMP和替加環(huán)素等藥物的敏感性[5-7]。Kim等[8]首次從魚的巴氏桿菌多重耐藥R質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了耐氟苯尼考的基因,并將其定名為pp2flo。隨后又相繼從沙門氏菌、大腸桿菌和葡萄球菌屬中克隆到氟苯尼考耐藥基因floR、cfr和fexA。后來(lái)雞源、牛源和豬源大腸桿菌中的floR基因也相繼被報(bào)道。現(xiàn)已證實(shí)floR基因同時(shí)對(duì)氯霉素和氟苯尼考耐藥。故對(duì)編碼多藥外排泵的oqxAB以及floR基因進(jìn)行檢測(cè)分析,對(duì)獸醫(yī)臨床治療及公共衛(wèi)生菌研究有重要意義。

近年來(lái),oqxAB在腸桿菌科細(xì)菌中的檢測(cè)分析較多,主要集中在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌[7-11],而在沙門菌中的研究報(bào)道較少[12]。本文測(cè)定了分離的豬源沙門菌對(duì)外排泵oqxAB代表性相關(guān)藥物的敏感性,用PCR及測(cè)序方法檢測(cè)了oqxAB,并分析了分離菌中oqxAB基因的分布流行特點(diǎn),旨在為有效控制沙門氏菌感染提供理論依據(jù);此外,對(duì)試驗(yàn)菌株用ERIC-PCR方法進(jìn)行了基因分型,了解oqxAB基因陽(yáng)性菌之間的克隆關(guān)系,以期為進(jìn)一步研究oqxAB基因的傳播擴(kuò)散機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 215株已鑒定的豬源沙門氏菌于2016～2018年采集于全國(guó)7個(gè)不同的省份(陜西、山西、湖北、河南等地)。質(zhì)控菌大腸埃希菌ATCC25922由中國(guó)普通微生物菌種保管中心提供。

1.1.2 藥物及培養(yǎng)基 試驗(yàn)藥物:喹乙醇(OQX,95.5%,江蘇天成動(dòng)物保健品公司)、痢菌凈(MEQ,99.1%,南通市合成獸藥廠)、氟苯尼考(FFC,99.5%, Amresco公司)、恩諾沙星(ENR,99.8%,北京萬(wàn)佳首化生物科技有限公司)。培養(yǎng)基: SS瓊脂、LB肉湯、MHB肉湯。

1.1.3 分子生物試劑 瓊脂糖、DNA Marker、Premix Ex Taq等購(gòu)自北京康為世紀(jì)有限公司;50×TAE購(gòu)自北京索萊寶有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器(金壇華峰儀器有限公司)、PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)、超凈工作臺(tái)(蘇靜集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、GENE GENIUS全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)、電泳儀(北京市六一儀器廠)、細(xì)菌比濁儀(法國(guó)Biomerieux)、AB204-N型電子分析天平(梅特勒-托里儀器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法,分別測(cè)定喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星對(duì)分離菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concertration, MIC),按照美國(guó)臨床試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)[17]及Hansen等[3]的研究結(jié)果判讀試驗(yàn)結(jié)果并計(jì)算MIC50和MIC90。

1.2.2 基因檢測(cè)

1.2.2.1 提取基因組 從純化的SS瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于LB肉湯中,置于水浴恒溫振蕩器中震蕩12 h；然后吸取1 mL到1.5 mL EP管中,以12000 r/min離心5 min；棄去上清液,加入200 μL TE緩沖液,吹打至完全渾濁,在沸水中煮10～15 min,以12000 r/min離心3 min,保留上清液。

1.2.2.2 基因的PCR及測(cè)序 通過(guò)PCR擴(kuò)增oqxA、oqxB和floR基因,擴(kuò)增用引物參照文獻(xiàn)[17-18]進(jìn)行設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

以基因DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系:10 μL Premix Ex Taq酶,上、下游引物、模板DNA各1 μL, ddH2O 1 μL,設(shè)1對(duì)空白對(duì)照。反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)熱5 min,94 ℃變性4 min,退火(根據(jù)不同的引物設(shè)置不同的溫度)45 s,72 ℃延伸(30 s/500 bp),循環(huán)30～35次；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%(ERIC PCR產(chǎn)物需1.8%)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色，在紫外投射儀下觀察結(jié)果并用凝膠成像系統(tǒng)攝像,如果出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照在同一位置的條帶即為陽(yáng)性,說(shuō)明該菌株攜帶有此種耐藥基因。將代表性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果經(jīng)“http://blat.ncbi.nlm.nih.gov/Blast”網(wǎng)上比對(duì)確認(rèn)。

1.2.3 ERIC-PCR分型 提取oqxA或oqxB基因檢測(cè)呈陽(yáng)性的豬沙門氏菌基因組為模板,利用ERIC-2[19]引物5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用NTSYSpc 2.1軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析,凡相似度大于75%者為同一型,代表同一克隆株。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

豬沙門氏菌耐藥表型和MIC分布范圍見表1。由表1可知：215株分離菌中對(duì)喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星耐藥的分別有70、45、199和36株,耐藥率分別為32.56%、20.93%、92.56%、16.74%;對(duì)喹乙醇和痢菌凈均耐藥的有24株；喹乙醇、痢菌凈、氟苯尼考和恩諾沙星對(duì)豬沙門氏菌的MIC50分別為32、32、128、1 μg/mL, MIC90分別為128、64、512、8 μg/mL。

表1 4種藥物對(duì)215株豬源沙門氏菌的MIC值分布

2.2 oqxA和oqxB檢測(cè)結(jié)果

在215株豬源沙門氏菌中分別有152、159株菌攜帶oqxA和oqxB,攜帶率分別為70.70%和73.95%。有152株菌同時(shí)攜帶oqxA和oqxB,共同攜帶率為70.70%，即并未發(fā)現(xiàn)單獨(dú)攜帶oqxA的菌株。有56株菌不含任何1個(gè)oqxA或oqxB。豬沙門氏菌oqxAB基因以及floR基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果分別見圖1和圖2。攜帶oqxA或oqxB的豬源沙門氏菌對(duì)喹乙醇、痢菌凈的敏感性表型測(cè)定結(jié)果見表2。

2:攜帶oqxA的菌株樣品;4:攜帶oqxB的菌株樣品;

6:陰性對(duì)照;7:攜帶floR基因的菌株樣品;8:陽(yáng)性對(duì)照。

藥物抗性菌株數(shù)(抗性率)oqxA攜帶率/%oqxB攜帶率/%喹乙醇70(70/215)82.86(58/70)84.29(59/70)痢菌凈145(145/215)64.83(94/145)68.97(100/145)

2.3 ERIC分型結(jié)果

對(duì)含有oqxA或oqxB的159株豬源沙門氏菌進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增,按相似度大于75%者為同一型,可分A～Q共17個(gè)型,每個(gè)型分別含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,oqxA或oqxB在各個(gè)型中均存在(圖3),說(shuō)明含有oqxA或oqxB基因的菌株既來(lái)源于不同的克隆,也有部分菌株來(lái)自同一克隆。

3 討論

沙門氏菌是最常見的人畜共患病原菌之一,具有較強(qiáng)的致病性,對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)。目前,無(wú)論是人類臨床治療,還是農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)的生產(chǎn)中,抗生素仍然是對(duì)付各種病原菌的首要選擇。由于抗菌藥物的不規(guī)范使用,尤其濫用現(xiàn)象嚴(yán)重,導(dǎo)致耐藥菌株逐年增長(zhǎng),細(xì)菌耐藥問(wèn)題變得愈加突出。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：215株豬源沙門氏菌對(duì)喹乙醇的耐藥率為32.56%,低于王敖雪等[14]報(bào)道的肉雞沙門氏菌對(duì)喹乙醇的耐藥率(100%)，也低于狄文婷等[15]描述的豬源沙門氏菌對(duì)喹乙醇的耐藥率58.3%；本試驗(yàn)豬源沙門氏菌對(duì)氟苯尼考的耐藥率為92.56%，明顯高于黃凱等[16]報(bào)道的對(duì)氟苯尼考的耐藥率(66.67%);對(duì)恩諾沙星的耐藥率為16.74%,明顯低于劉艷紅等[17]報(bào)道的豬源沙門氏菌和大腸桿菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率(66.7%)。這種耐藥率的差異,可能與養(yǎng)豬場(chǎng)的地理位置、所處環(huán)境不同,抗生素的使用方法和劑量有關(guān)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),有11.16%的菌株對(duì)喹乙醇和痢菌凈同時(shí)耐藥,說(shuō)明豬源沙門氏菌對(duì)喹噁啉類藥物存在一定的交叉耐藥性。

從表1和表2可以看出,豬源沙門氏菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為70.70%和73.95%,同時(shí)攜帶oqxA、oqxB的菌株所占比例為70.70%,說(shuō)明oqxAB已有較高的流行率。宮艷彬等[18]報(bào)道的死亡鴨胚沙門菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為9.46%和2.70%,遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)。江萍等[19]報(bào)道的新疆地區(qū)豬源沙門氏菌中oqxA和oqxB的攜帶率分別為64.7%和65.5%,這與本試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本相近。由此可以看出,因地理位置不同,菌株來(lái)源及宿主不同,分離菌中oqxA和oqxB的攜帶率存在較大的差異。本試驗(yàn)菌株采集自全國(guó)7個(gè)省份,較為廣泛,具有一定的代表性。oqxA和oqxB位于同一操縱子上,本試驗(yàn)中oqxA的檢出率低于oqxB的檢出率,可能是由于oqxA引物的結(jié)合位點(diǎn)存在突變而使部分菌株的oqxA無(wú)法檢出。此外,在215株豬源沙門氏菌中分別有152和159株菌攜帶oqxA和oqxB,但是分別只有70和45株菌對(duì)喹乙醇和痢菌凈耐藥。在本試驗(yàn)中，豬源沙門氏菌菌株對(duì)oqxA和oqxB的攜帶率(分別為70.70%和73.95%)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)喹乙醇和痢菌凈的耐藥率(分別為32.56%和20.93%),表明部分oqxA或oqxB基因并未表達(dá)。同時(shí),在對(duì)喹乙醇耐藥的菌株中，oqxA和oqxB的檢出率分別為82.86%和84.29%,高于對(duì)喹乙醇不耐藥的菌株中oqxA和oqxB的檢出率(分別為64.83%和68.97%)。說(shuō)明oqxA和oqxB是導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)喹乙醇耐藥的主要機(jī)制。而對(duì)氟苯尼考的耐藥率為92.56%,明顯高于floR的檢出率72.56%,這可能是由于新的耐藥基因或本試驗(yàn)中未檢測(cè)的其他有關(guān)耐藥基因的存在,同時(shí)還有可能是oqxA、oqxB的存在致使氟苯尼考的耐藥性增強(qiáng)。

圖3 含有oqxA或oqxB基因的菌株ERIC分型圖

由圖3的ERIC-PCR結(jié)果可以看出,含有oqxA或oqxB的159株豬源沙門氏菌可分為A～Q共17個(gè)ERIC型,各個(gè)型分別含有47、39、1、23、2、23、2、1、2、2、3、2、1、2、3、5、1株菌,由此可見含有oqxA或oqxB的豬源沙門氏菌分離株多數(shù)來(lái)自不同的克隆株,oqxA和oqxB廣泛存在于不同的克隆菌株中。