白金運(yùn)，高 鑫

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院內(nèi)分泌及代謝科，復(fù)旦大學(xué)代謝疾病研究所，上海 200032

凝血酶敏感蛋白(thrombospondins, TSP)是一種可以介導(dǎo)多種生物學(xué)過(guò)程的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，作為細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，可傳遞一系列信號(hào)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)的相互作用[1-2]。TSP家族包含凝血酶敏感蛋白1～5。凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin-1, TSP-1)是該家族中最早發(fā)現(xiàn)的蛋白。近年來(lái)，人們對(duì)TSP-1的生物學(xué)特性和功能研究較多，TSP-1與糖脂代謝的關(guān)系也是目前研究的熱點(diǎn)之一。

1 凝血酶敏感蛋白1的發(fā)現(xiàn)與生物學(xué)特點(diǎn)

1971年，Baenziger等[3]采用凝血酶刺激完整的人血小板后，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)比發(fā)現(xiàn)，一條相對(duì)分子質(zhì)量(Mw)為190 000的蛋白條帶在凝血酶處理后消失，研究人員推測(cè)這可能是由于該條帶所代表的蛋白被凝血酶水解，并因此命名為凝血酶敏感蛋白(thrombin-sensitive protein, TSP)。結(jié)合該研究團(tuán)隊(duì)之前的發(fā)現(xiàn)，凝血酶會(huì)引起甘油進(jìn)入血小板后細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸雙層結(jié)構(gòu)的增加，Baenziger等推測(cè)這種凝血酶敏感蛋白可能參與了凝血酶促進(jìn)血小板磷脂合成的過(guò)程。

隨后的研究[4]揭示了TSP-1是具有多種功能域的同源三聚體糖蛋白，分子量約為450 kDa，其單體亞單位分子量為140 kDa。編碼TSP-1的基因THBS-1位于第15號(hào)染色體的q11-qter位點(diǎn)。TSP-1的空間結(jié)構(gòu)是由3條通過(guò)二硫鍵鏈接的多肽鏈構(gòu)成的，在細(xì)胞外分為不同的功能區(qū)域。氨基端是肝素結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)TSP-1蛋白的遷移和攝取，同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞的黏附和趨化。原膠原區(qū)參與抑制血管新生，隨后是3段重復(fù)序列(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型)，參與細(xì)胞黏附、遷移、生長(zhǎng)和血管新生[5]。最后是羧基端，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、遷移、血小板聚集和一氧化氮(NO)信號(hào)(圖1)。

圖1 TSP-1的結(jié)構(gòu)和相關(guān)受體/配體

2 TSP-1受體與作用機(jī)制

TSP-1的受體最早由Asch等[4]在1987年發(fā)現(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)1種叫作OKM5的單克隆抗體可以抑制TSP-1與激活的血小板之間的結(jié)合，進(jìn)一步采用免疫沉淀確定了1種分子量為88 kDa可以與OKM5結(jié)合的糖蛋白，可能是TSP-1的膜受體。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，已知OKM5可以與分子量大小約為90 kDa的糖蛋白Ⅳ(GPⅣ)(即CD36)結(jié)合，并且GPⅣ的抗體也可以抑制TSP-1與激活的血小板之間的結(jié)合。因此，研究人員推測(cè)GPⅣ是TSP-1的膜受體。隨后1992年的研究[8]采用CD36的正義或反義cDNA特異性敲低CD36后研究TSP-1的作用，證實(shí)了GPⅣ(CD36)是TSP-1的膜受體。

CD36是1種廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面的清道夫受體，具有脂肪酸轉(zhuǎn)位酶的作用，TSP-1可以誘導(dǎo)CD36的二聚化[9]。CD36存在于多種細(xì)胞表面，如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞[10-11]。Leung等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD36與TSP-1的Ⅰ型重復(fù)區(qū)結(jié)合，激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，負(fù)向調(diào)節(jié)血管再生(圖2)。

圖2 CD36介導(dǎo)TSP-1抗血管新生作用示意圖

VEGFR2：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子2；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；TSR：凝血酶敏感蛋白Ⅰ型重復(fù)區(qū)；Fyn：原癌基因蛋白酪氨酸激酶；p38 KAP kinase：p38促分裂素原活化蛋白激酶

在腎足細(xì)胞中，TSP-1結(jié)合CD36可以激活p38-MAPK通路，誘導(dǎo)腎足細(xì)胞的凋亡；另外，游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)通過(guò)與CD36的FFA結(jié)合位點(diǎn)(p127-279)[13]結(jié)合，導(dǎo)致足細(xì)胞MAPK通路激活，進(jìn)而刺激TSP-1的表達(dá)，TSP-1分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，與CD36的TSP-1結(jié)合位點(diǎn)(p93-110)[14]結(jié)合誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡和功能紊亂[15]。巨噬細(xì)胞中，TSP-1結(jié)合CD36可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞激活[16]。TSP-1還可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮對(duì)脂肪細(xì)胞的代謝調(diào)控作用。研究[17]發(fā)現(xiàn)TSP-1是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)的關(guān)鍵激活物質(zhì)，可能是通過(guò)CD36受體介導(dǎo)這一信號(hào)，使得TGF-β的信號(hào)通路易化，這一作用不僅存在于脂肪細(xì)胞中，還存在于非脂肪細(xì)胞中。升高的TSP-1可以激活TGF-β[18]，激活的TGF-β進(jìn)一步刺激腎臟系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如Ⅳ型膠原，導(dǎo)致腎臟纖維化。另外，TSP-1通過(guò)CD36途徑參與腫瘤轉(zhuǎn)移及炎癥反應(yīng)。

CD47表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等上。CD47被TSP-1的羧基端激活后抑制細(xì)胞環(huán)鳥(niǎo)甘酸(cGMP)的產(chǎn)生(圖3)[19]。NO介導(dǎo)可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)的激活進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)cGMP水平(NO-sGC-cGMP通路)，這一機(jī)制發(fā)生在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、血小板或炎性細(xì)胞中，具有促血管舒張、血小板解凝集的作用。TSP-1可以通過(guò)結(jié)合CD36或CD47受體抑制上述作用。其中，TSP1-CD36信號(hào)通路是抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO-sSC信號(hào)的充分條件，TSP-1或TSP-1類似物如ABT-510結(jié)合CD36后，抑制了CD36的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)活性，并抑制NO的生成[20]。但TSP-1通過(guò)CD36受體對(duì)NO-sGC-cGMP信號(hào)通路的抑制作用需要CD47受體的存在[21]：CD36-/-的肌肉組織塊和內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)TSP-1介導(dǎo)的NO-sGC-cGMP通路抑制作用仍然存在，而TSP-1的這一抑制作用在CD47-/-的組織塊中不再發(fā)生，并且CD47-/-的內(nèi)皮細(xì)胞sGC和cGMP的水平升高。因此，CD47是TSP-1發(fā)揮對(duì)NO-sGC-cGMP通路抑制作用的必要條件。

圖3 CD47介導(dǎo)TSP-1抑制NO依賴性環(huán)鳥(niǎo)苷酸生成

Arginine：精氨酸；eNOS：內(nèi)皮型一氧化氮合酶；NO：一氧化氮；sGC：可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶；cGMP：環(huán)鳥(niǎo)甘酸

3 TSP-1與糖脂代謝

TSP-1可以與細(xì)胞表面一系列的受體結(jié)合，包括上述介紹的CD36、CD47，還有蛋白聚糖、整合蛋白等，并且可以結(jié)合蛋白酶生長(zhǎng)因子和多種生物活性分子，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如組織修復(fù)中的止血、細(xì)胞黏附、遷移、增殖凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)和重組、調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子活性和細(xì)胞骨架重組[5,22]。目前關(guān)于TSP-1的研究主要集中在新生血管的形成、細(xì)胞纖維化與凋亡、癌癥發(fā)生發(fā)展以及對(duì)細(xì)胞質(zhì)微環(huán)境的影響等領(lǐng)域。近年來(lái)，TSP-1在代謝性疾病中的作用逐漸引起了學(xué)者們的興趣。如在肥胖和糖尿病模型中TSP-1的表達(dá)明顯上調(diào)[23]，其表達(dá)水平與炎癥活動(dòng)及代謝紊亂程度相關(guān)聯(lián)，是脂肪細(xì)胞核巨噬細(xì)胞導(dǎo)致脂肪組織炎癥的重要紐帶。目前，關(guān)于TSP-1在糖脂代謝領(lǐng)域的研究還處于表型研究階段，并且還存在一些相互矛盾的結(jié)果；另外TSP-1參與糖脂代謝的作用機(jī)制還缺乏深入的研究，其通路是否與上述TSP-1在腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)、血管新生中的CD36下游或CD47下游信號(hào)途徑相關(guān)還需要更多的研究。本文將就目前TSP-1在糖脂代謝領(lǐng)域的研究工作做一總結(jié)，并初步提出可能涉及的機(jī)制研究方向。

3.1 TSP-1對(duì)脂質(zhì)代謝的影響 短期高脂喂養(yǎng)(45% HFD，3周)小鼠可以檢測(cè)循環(huán)中的TSP-1表達(dá)量明顯上升，而TSP-1基因(即Thbs1基因)敲除(Thbs1-null)小鼠高脂喂養(yǎng)不再出現(xiàn)顯著的體質(zhì)量增加和脂肪細(xì)胞肥大。高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)顯示：Thbs1-null小鼠不再出現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗。組織特異性葡萄糖攝取試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Thbs1-null小鼠的胰島素敏感的表型主要由骨骼肌細(xì)胞介導(dǎo)[24]。有趣的是，在高脂喂養(yǎng)的Thbs1-null小鼠皮下脂肪組織中還發(fā)現(xiàn)與解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)陽(yáng)性的棕色脂肪類似的結(jié)構(gòu)，這可能也是其代謝改善的一個(gè)利好因素。

另一項(xiàng)長(zhǎng)期高脂喂養(yǎng)研究[25]提供了不盡相同的結(jié)果，Kong等用60%的高脂飲食喂養(yǎng)小鼠5個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高脂組小鼠性腺周圍組織TSP-1表達(dá)顯著增高，TSP-1的表達(dá)主要存在于脂肪間質(zhì)中；并且未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞的TSP-1的表達(dá)量高于已分化的脂肪細(xì)胞，除了脂肪細(xì)胞之外，脂肪組織的血管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞都可以高表達(dá)TSP-1。與野生型小鼠相比，高脂喂養(yǎng)的Thbs1-null小鼠血清游離脂肪酸和三酰甘油水平顯著上升，這提示TSP-1可能參與了脂質(zhì)的攝取過(guò)程，但在前文短期高脂喂養(yǎng)研究[24]中未發(fā)現(xiàn)Thbs1-null對(duì)血清脂質(zhì)濃度的影響。

3.2 TSP-1對(duì)胰島素敏感性的影響 Thbs1-null小鼠高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)顯示Thbs1-null小鼠不再出現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的胰島素抵抗，組織特異性葡萄糖攝取試驗(yàn)進(jìn)一步提示Thbs1-null小鼠的胰島素敏感的表型主要由骨骼肌細(xì)胞介導(dǎo)[24]。有研究[26]采用重組的TSP-1蛋白作用于培養(yǎng)的C2C12肌小管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TSP-1可以激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38及IKK信號(hào)通路并呈劑量依賴性關(guān)系，上述激活的信號(hào)通路可以誘導(dǎo)胰島素受體底物1(insulin receptor substance 1, IRS1)Ser636/639位點(diǎn)絲氨酸磷酸化從而抑制胰島素信號(hào)通路，這與TSP-1處理可以降低胰島素依賴的Akt磷酸化水平的結(jié)果相符，證明了在肌肉細(xì)胞中TSP-1通過(guò)以上信號(hào)途徑誘導(dǎo)了胰島素抵抗的產(chǎn)生。然而，在HepG2肝癌細(xì)胞中，TSP-1僅能激活JNK與p38，并未引起IKK的激活，也未能引起IRS1絲氨酸磷酸化的增加。然而，在年老的Thbs1-null小鼠(小鼠齡大于1年)中，研究[27]發(fā)現(xiàn)TSP-1缺失的小鼠胰島血管增多，葡萄糖耐量試驗(yàn)顯示胰島β細(xì)胞功能受損，與野生型小鼠相比，胰島β分泌的胰島素僅為野生型的15%。

3.3 TSP-1在非酒精性脂肪肝中的作用 成年肝臟中，生理狀態(tài)下TSP-1可檢測(cè)的表達(dá)很低或檢測(cè)不出表達(dá)[28]。有研究[29]將肝內(nèi)各細(xì)胞分離檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TSP-1在肝竇血管內(nèi)皮細(xì)胞中有表達(dá)，染色示TSP-1在肝竇周圍(Disse腔)形成細(xì)小彎曲的纖維狀結(jié)構(gòu)；肝星狀細(xì)胞分離培養(yǎng)7 d后也可以大量表達(dá)TSP-1，并且表達(dá)出的TSP-1在細(xì)胞周圍沉積為纖維性的基質(zhì)；生理狀態(tài)分離的肝細(xì)胞未檢測(cè)出TSP-1表達(dá)。在病理狀態(tài)下，如先天性肝纖維化患者的肝細(xì)胞可以檢測(cè)TSP-1的表達(dá)量增高，肝星狀細(xì)胞TSP-1的分泌量更高。在體外構(gòu)建的非酒精性脂肪肝模型中，游離脂肪酸處理肝細(xì)胞增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同時(shí)促炎細(xì)胞因子和TSP-1的表達(dá)增多[30]。在局部肝切除的小鼠模型中，酒精處理的大鼠、四氯化碳或3,5-二乙氧羧基-1,4-二氫可力丁誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化模型中肝星狀細(xì)胞可以表達(dá)TSP-1。另外，酒精性肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的肝硬化或其他肝纖維化患者均可以檢測(cè)出TSP-1的上調(diào)[31-32]。

3.4 TSP-1在糖脂代謝領(lǐng)域的研究前景 雖然TSP-1與胰島素抵抗及脂肪肝的關(guān)系已有一定數(shù)量的文獻(xiàn)報(bào)道，但是TSP-1如何參與這一過(guò)程的具體機(jī)制還缺乏研究。TSP-1參與糖脂代謝是否通過(guò)TSP-1的受體如CD36、CD47介導(dǎo)，相互作用的位點(diǎn)是否具有特異性，作用后如何與經(jīng)典的糖代謝、脂代謝的通路產(chǎn)生Crosstalk等問(wèn)題還需進(jìn)一步探究。例如，在非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制中，肝細(xì)胞的脂肪酸攝取、脂質(zhì)生成、β氧化及三酰甘油以極低密度脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的失衡是始動(dòng)因素[33-35]，TSP-1在以上哪一環(huán)節(jié)發(fā)揮何種作用還缺乏深入的研究。其中多種關(guān)鍵信號(hào)如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulating element binding protein 1c, SREBP-1c)、乙酰輔酶A羧化酶2(acetyl-CoA carboxylase 2, ACC2)、肉毒堿棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1, CPT-1)及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)等與TSP-1的關(guān)系尚缺乏研究。如何闡明TSP-1在肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積中的具體機(jī)制，還需要通過(guò)研究確定以上這些關(guān)鍵信號(hào)通路是否參與了TSP-1影響肝細(xì)胞脂代謝的過(guò)程和通過(guò)何種受體介導(dǎo)，解決這些問(wèn)題可為非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制研究提供新的方向。

4 小 結(jié)

綜上所述，TSP-1是具有多種功能的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，肥胖及糖尿病可伴隨TSP-1的表達(dá)上調(diào)。脂肪組織中TSP-1的表達(dá)可介導(dǎo)脂肪組織炎癥反應(yīng)，并影響組織對(duì)脂肪酸的攝取。并且，TSP-1在肝臟疾病，如非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。作為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，TSP-1是通過(guò)特定的功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。因此，基于多肽特異性結(jié)合位點(diǎn)研究小分子類似物或抑制劑，可進(jìn)一步揭示TSP-1參與糖脂代謝的細(xì)胞和分子機(jī)制，并為肥胖、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥提供新的治療手段。