孟苗婧,郭曉平,張金池,*,趙友朋,吳家森,葉立新,瞿承偉,劉勝龍

1 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇省水土保持與生態(tài)修復重點實驗室,南京林業(yè)大學林學院,南京 210037 2 環(huán)保部南京環(huán)境科學研究所,南京 210042 3 浙江農(nóng)林大學資源與環(huán)境學院,臨安 311300 4 鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)鳳陽山管理處,龍泉 323700

土壤微生物是土壤的重要組成部分,對土壤肥力的形成和轉化起著積極作用,是土壤質量評價不可缺少的土壤生物學指標[1- 3],同時,土壤微生物群落結構被認為是土壤生態(tài)系統(tǒng)的預警及敏感指標之一[4],它在調節(jié)土壤養(yǎng)分和生態(tài)系統(tǒng)過程中起著重要的作用,是植物生長和維持的關鍵[5-6]。土壤細菌對土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的物質和能量的轉化作用顯著[7],土壤真菌及放線菌可以在土壤顆粒間形成菌絲橋[8],從而影響土壤團粒結構[9]。真菌主導的土壤微生物類群對改善土壤有機碳穩(wěn)定性比細菌更加重要[10],因此土壤真菌與細菌的相對豐度也對土壤生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展有著作用[11]。

然而,微生物類群對植被及生境的選擇有明顯的對應性[12],所以群落的組成和多樣性在很大程度上受土壤環(huán)境條件,特別是土壤理化因子的影響[13-14]。森林土壤的養(yǎng)分積累和平衡狀況存在差異[15],其空間變異主要受海拔、地形、植被等因素的影響[16-17]。海拔梯度是檢驗地球物理影響下植物群落生態(tài)進化反應的最有力的“自然實驗”[18]。海拔梯度的變化意味著短距離內氣候因子的急劇變化[19],如溫度,降水等[20]。近年來溫室效應加劇,高海拔地區(qū)的生態(tài)環(huán)境也隨之改變[21],研究典型植被類型對海拔變化的響應可以解釋植物對環(huán)境的適應[22],研究微生物多樣性對海拔梯度的響應也為幫助我們更好的理解微生物對氣候變化的響應[23]。

鳳陽山自然保護區(qū)是森林生態(tài)類型自然保護區(qū),原始植被類型為亞熱帶常綠闊葉林[24],這也是亞洲東部的主要自然植被類型之一[25]。20世紀60—70年代,鳳陽山自然保護區(qū)進行了間伐等措施,對森林進行管理。后又補植了黃山松、杉木、柳杉等針葉樹種,形成了了杉木純林、柳杉純林、竹林及針闊混交林等植被類型[26]。作為我國東部亞熱帶山地有代表性的針葉樹種之一[27],黃山松在高山植被恢復、固碳、水源涵養(yǎng)及應對全球氣候變化方面比其他松科植物更為重要的價值[28]。黃山松為重要組成樹種的黃山松闊葉混交林主要分布在800—1800 m,有關黃山松的研究較少,且多集中在黃山松的分類、群落、生長特性及遺傳分化等方面[29- 32],但有關黃山松為重要組成部分的高海拔針闊混交林對氣候變化的響應研究仍有欠缺。磷脂脂肪酸(PLFA) 技術作為一類較為常見并且快捷、準確的微生物生物標記法[33],目前已在國內外土壤微生物群落組成和種群變化方面得到廣泛應用。本文主要利用PLFA方法研究了鳳陽山不同海拔黃山松林土壤微生物群落結構,為黃山松的利用、保護及其對氣候變化的響應提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省龍泉市南部鳳陽山—百山祖國家級自然保護區(qū)(119°06′—119°15′E,27°46′—27°58′N),保護區(qū)現(xiàn)有管理面積15171 hm2,鳳陽山保護區(qū)主峰為黃茅尖,海拔1929 m,是江浙第一高峰。保護區(qū)所處位置屬中亞熱帶溫暖濕潤氣候區(qū),年均降水量達2400 mm,年均氣溫12.3℃,四季分明,雨量充沛。保護區(qū)內森林植被類型豐富,有11個植被類型,其中主要植被型有5個,分別為針葉林(800—1600 m)、針闊混交林(1200—1800 m)、常綠落葉闊葉混交林(1200—1650 m)、常綠闊葉林(1300—1700 m)、山頂矮曲林(1400 m以上)。以黃山松(Pinustaiwanensis)為重要建群種的黃山松闊葉混交林是保護區(qū)內針闊混交林中的典型群系,分布在海拔800—1800 m,其中闊葉樹種主要為木荷 (Schimasuperba)、青岡(Cyclobalanopsisglauca)、柃木(Euryajaponica)等。

1.2 樣品采集

選取鳳陽山主峰黃茅尖海拔800—1800 m范圍內的黃山松針闊混交林為研究對象。2016年8月,在此范圍內設置5個海拔梯度(900、1100、1300、1500、1700 m),在每個海拔梯度的陽坡內選取排水較好、坡度較緩、長勢適中的3個樣方,每個樣方20 m×20 m。由于海拔差異較大,黃山松針闊混交林內闊葉林組成不同,因此我們在每個樣方內用蛇形法設置5個樣點,取樣時將土壤表面枯落物和腐殖質層移開,采集表層(0—20 cm土層)的土壤樣品500 g,然后將5個樣點所采集的土壤進行混合,作為該樣地的土壤樣品,并用密封袋密封之后,放入冰盒帶回實驗室。土樣過2 mm篩后,分為兩份,一份風干進行土壤養(yǎng)分等的測定,另一份放入-20℃冰箱待測。樣地基本特征見表1。

表1 樣地林分基本特征

1.3 測定方法

土壤理化性質測定：土壤pH采用pH計測定(水土比2.5∶1);土壤容重及含水量用環(huán)刀取樣后稱量法測定[34];土壤有效磷含量采用鉬銻抗比色法測定,土壤有機碳采用重鉻酸鉀外加熱法測定[35];總氮、總磷采用流動分析儀測定(Bran+Luebbe); 土壤微生物群落結構多樣性采用磷脂脂肪酸方法(PLFA)[36],采用修正的Bligh-Dyer 方法進行脂類提取和磷脂脂肪酸分析：土樣用體積比為1∶2∶0.8的氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液振蕩提取總脂類,然后經(jīng)SPE硅膠柱分離得到磷脂脂肪酸,將得到的磷脂脂肪酸進行堿性甲酯化,用Agilent 6890N 氣相色譜儀分析PLFA的成分,內標為正十九烷酸甲酯(19:0)[37]。

本研究選取了6種指標,其中表征的磷脂脂肪酸如下：革蘭氏陽性細菌(13:0iso,15:0iso,15:0anteiso,16:0iso,17:0iso,17:0anteiso,18:0iso);革蘭氏陰性細菌(10:0 2OH,16：1ω9c,16:1ω7c,17:1ω7c,17:1ω8c,17:1ω9c,16:0 2OH,18:1ω7c,18:1ω5c);放線菌(16:0 10-methyl,18:010-methyl);厭氧菌(17:0 ω7c,19:0cycloω9c,19:0cycloω7c);16:1ω5c;SEM真菌(18:2ω6c,18:1ω9c)。由于16:1ω5c被發(fā)現(xiàn)在G-和AM fungi中同時存在,且所占比重較大。同時,16:1ω5c是表征AM fungi的一個重要的磷脂脂肪酸。因此,本研究選取16:1ω5c作為一個獨立的指標來表征微生物的數(shù)量[24]。本文中我們用磷脂脂肪酸的相對豐度分析反映微生物群落組成[38]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

土壤理化性質及微生物群落的相對豐度(革蘭氏菌、革蘭氏細菌、放線菌、厭氧菌、16:1ω5C和SEM真菌)在各海拔梯度之間的差異,使用單向方差分析(ANOVA)和最小顯著性差異(LSD)分析,數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時,采用K檢驗。土壤理化性質與土壤微生物群落結構之間的差異采用非度量多維標度(NMDS),所用分析使用R語言進行(“vagan”軟件包)[39]。

2 結果與分析

2.1 海拔變化對黃山松林地土壤理化性質的影響

隨海拔升高,土壤理化性質出現(xiàn)了顯著變化(表2)。土壤pH值、容重及土壤含水量無明顯的變化規(guī)律,但在各海拔之間有顯著性差異(P<0.05)。土壤有機碳、總氮、總磷及有效磷含量在中海拔(1100—1500 m)處較高,在海拔1700 m處均顯著降低(P<0.05)。但各指標最大值并不出現(xiàn)在同一海拔高度。

表2 土壤理化性質

TOC：total organic carbon; TN: total nitrogen; TP: total phosphorus; AP: available phosphorus,同列不同字母表示差異顯著P<0.05,n=3

2.2 海拔變化對黃山松林地土壤微生物群落結構的影響

隨海拔變化,黃山松闊葉林土壤微生物各群落均顯示出一定差異(圖1)。高海拔處(1300—1700 m)革蘭氏陰性細菌豐度顯著低于低海拔 (900—1100 m,P<0.05,圖1),而相對豐度最高的革蘭氏陰性細菌則表現(xiàn)出相反的特征,高海拔處 (1500—1700 m) 相對豐度顯著高于其他海拔 (P<0.05,圖1)。1500 m海拔的放線菌和豐度顯著低于其他海拔 (P<0.05),其中900 m處的豐度值最高(圖1)。厭氧菌相對豐度同樣在1500 m處最低,但只顯著低于1100 m和1300 m處的豐度值(圖1)。16：1ω5c和真菌的相對豐度則是隨著海拔先升高后下降,在1300 m海拔處達到最高值。

圖1 5個海拔梯度不同微生物類群的相對豐度Fig.1 Relative abundance of different microbial groups at different elevations不同字母表示P<0.05時差異顯著

圖2 土壤微生物群落豐度的非度量多維尺度分析 Fig.2 Nonmetric multidimensional scaling analysis (NMDS) showing the overall composition of microbial communities

非度量多維標度(NMDS)排序結果顯示(圖2)。從整個NMDS排序圖中(圖2)可以看出5個海拔梯度針闊混交林地土壤微生物群落結構被劃分為3個類群,即海拔900、1100 m為主的較低海拔土壤微生物群落類群;海拔1300 m的中海拔土壤微生物群落類群及以海拔1500、1700 m為主的高海拔土壤微生物群落類群。從空間角度來看,地理空間上相近的樣點聚為一類。

對各海拔梯度樣點在NMDS 兩軸上得分進行分析(表3)。沿NMDS 1 軸,海拔900、1100、1300 m與海拔1500、1700 m處得分有顯著差異(P<0.05)。而海拔1300 m處得分則與海拔900、1500、1700 m處沿NMDS 2軸有顯著差異(P<0.05)。

2.3 土壤微生物群落組成與土壤理化性質間的關系

對各海拔針闊混交林土壤微生物群落組成與土壤因子漸進進行冗余分析(RDA),RDA軸1和軸2能共同解釋所有變量的71.3%,模擬效果較好(圖3)。冗余分析中,向量的長度與該因子的重要性成正比;土壤理化性質向量與微生物對碳源的利用向量之間的夾角余弦值表示他們之間的相關系數(shù)[40]。結果表明,土壤微生物群落結構組成與土壤理化性質之間相關性較好。土壤革蘭氏陽性細菌與放線菌正相關;土壤厭氧菌與革蘭氏陰性細菌豐度負相關。土壤pH值、有機碳含量與總氮含量顯著正相關;但是這些因子與容重和總磷含量負相關;土壤有效磷含量與含水量之間存在顯著正相關;海拔高度的變化影響了土壤環(huán)境因子的變化。土壤微生物群落組成中,放線菌、革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌及厭氧菌受土壤環(huán)境因子的影響較大。海拔高度的變化主要影響土壤放線菌及革蘭氏陽性細菌豐度,與其顯著負相關,此外還與革蘭氏陰性細菌正相關,對其他微生物群落豐度的影響較小。

表3 各海拔梯度樣點在NMDS軸上的得分

圖3 不同海拔針闊混交林地土壤微生物群落結構與土壤因子分冗余分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) between soil microbial community and soil properties

3 討論

海拔高度的變化通常會在較短的地理距離內引起氣候環(huán)境因子的變化及物質周轉的劇烈變化[19]。土壤微生物群落結構作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中較為敏感的指標,對周圍環(huán)境的變化會產(chǎn)生極為迅速的響應。本文研究發(fā)現(xiàn),隨海拔的升高,鳳陽山針闊混交林地土壤微生物群落組成也發(fā)生了變化。

通過NMDS降維分析,將5個海拔梯度的微生物群落組成分為3個類型類群。海拔900 m及1100 m處,土壤微生物群落中,革蘭氏陽性菌、放線菌及厭氧菌豐度較高;海拔1500 m及1700 m處,土壤革蘭氏陽性菌豐度顯著高于其他海拔;海拔1300 m處則擁有較低的細菌豐度。僅從土壤微生物群落組成的海拔效應上看,海拔變化主要影響土壤細菌及放線菌豐度的變化,對其他微生物群落影響較小。朱文杰研究了太白山北坡土壤放線菌的垂直分布,發(fā)現(xiàn)海拔800—1845 m范圍內,土壤放線菌 最高含量出現(xiàn)在1845 m,這與本文的研究結果相似[41]。土壤革蘭氏陽性與陰性細菌變化趨勢相反,隨海拔升高,革蘭氏陽性與陰性細菌的相對豐度分別呈現(xiàn)下降和升高趨勢,革蘭氏陰性細菌對高海拔環(huán)境的適應更有優(yōu)勢[42]。

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分,土壤微生物直接參與森林生態(tài)系統(tǒng)的物質循環(huán)和能量轉化,同時對穩(wěn)定團粒結構等方面也有明顯作用[43]。土壤微生物種類、群落結構、生物量等受氣候環(huán)境、植被群落結構及土壤性質等環(huán)境因子的影響。根據(jù)RDA分析的結果,海拔變化引起的土壤性質的變化一定程度上導致了土壤微生物群落的變化[44],由于森林土壤的異質性及植被類型的差異,各土壤因子對微生物群落的影響不同[45-46]。土壤性質對不同土壤微生物類群的作用不同[47]：土壤革蘭氏陽性細菌與放線菌豐度幾乎受到所有土壤因子的影響,這說明影響它們豐度的因素較復雜;土壤革蘭氏陰性細菌豐度則主要受到土壤容重、含水量及土壤有效磷含量的影響,其中容重為負相關,含水量及有效磷含量為正相關。許多研究都證明土壤N,P含量是影響土壤微生物群落的重要因素[48],但是在不同的研究區(qū)域影響效果有所差異。良好的土壤物理性質,也對土壤微生物群落結構的豐富作用顯著[49]。土壤微生物群落結構受土壤性質的影響,大都是多個因子的綜合作用結果[50]。

植物群落組成也顯著影響土壤微生物群落結構組成。一方面,大量研究探討了植物群落結構多樣性與土壤微生物群落組成及豐度之間的相互關系,發(fā)現(xiàn)較高的植物群落結構多樣性多伴隨著大的土壤微生物群落結構多樣性[14]。另一方面,有學者認為每種植物對生態(tài)系統(tǒng)的貢獻都是不同的,植物通過根系形態(tài)、分泌物及枯落物的分解影響著土壤微生物群落結構組成[51]。這些觀點都說明植物群落組成是影響土壤微生物群落結構的重要因素。海拔變化后,針闊混交林內部植物種類及組成均發(fā)生改變,這種差異及其引起土壤環(huán)境差異也是土壤微生物群落結構不同的重要因素[52-53]。

本研究利用磷脂脂肪酸(PLFA)技術測定土壤微生物群落組成,因為它可以直接提取原位土壤的PLFA,但是該方法的準確性對實驗條件要求較高,同時無法區(qū)分植物體與土壤的PLFA,因此利用分子生物學技術深入探討土壤微生物群落多樣性或許是我們進一步研究方向。

4 結論

風陽山不同海拔梯度土壤理化性質及土壤微生物群落組成均有差異。隨海拔升高,土壤養(yǎng)分含量大致呈現(xiàn)先升高后降低的變化特征,在海拔1100—1500 m范圍內養(yǎng)分含量較高。土壤pH值及容重分別與海拔高度呈正、負相關關系。土壤微生物群落組成中,土壤革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌及放線菌豐度與海拔高度的變化相關關系顯著,其他類群的土壤微生物豐度與海拔的相關性較弱。

土壤理化性質對土壤微生物群落豐度有一定的影響,土壤革蘭氏陽性細菌及放線菌豐度收土壤理化性質各因子的綜合影響,革蘭氏陰性細菌豐度則主要受到土壤含水量及有效磷含量的關系密切。