路興愛，吳 潔，趙振奧，胡士軍

(1.蘇州大學 心血管病研究所,江蘇蘇州 215000； 2.蘇州大學 附屬第一醫(yī)院心臟大血管外科,江蘇蘇州 215006)

干細胞領域的飛速發(fā)展給再生醫(yī)學帶來了革命性的改變．特別是人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs)，其無限制的自我更新能力及可分化成任何一種細胞的特性[1-2]，使其在干細胞研究、人類疾病模型建立、藥物篩選中發(fā)揮著巨大的作用，更是細胞治療的重要供體來源．然而進一步的研究發(fā)現(xiàn)hESCs的移植面臨著細胞存活率低、畸胎瘤形成、以及免疫排斥等一系列問題[3]，構建穩(wěn)定表達報告基因的細胞株可對移植干細胞的命運進行實時監(jiān)控，有助于移植策略的優(yōu)化．

多模態(tài)成像是指將光學成像與其他成像模式相結合，同時獲得多種參數(shù)的成像方式，最新的進展是三融合報告基因技術，由生物發(fā)光，熒光和PET(Positron Emision Tomograph)報告基因組成[4]．生物發(fā)光是生物利用體內(nèi)的酶將化學能轉(zhuǎn)化為光能而發(fā)光的一種現(xiàn)象，常見的酶包括螢火蟲熒光素酶(Fluc)和海腎熒光素酶(Renilla Luciferease, Rluc)等，可以通過與底物反應產(chǎn)生光，從而被電荷耦合器(CCD)捕獲，這種影像模式目前可用于小動物成像，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但是其固有的劣勢局限了在人類疾病臨床中的應用．熒光顯像，在生物學領域應用十分廣泛，常見的報告基因有copGFP、eGFP和RFP等，但是這種成像方式信噪比和靈敏度較低．PET是核醫(yī)學領域比較先進的臨床檢查影像技術，其分子探針為正電子核素(如放射性核素F18等)標記分子(HSV-ttk)，具有快速、高分辨率和高靈敏度顯像的特點，彌補了前兩種成像方式的不足．這種多模態(tài)成像的方式可更準確、敏感地跟蹤檢測移植細胞在體內(nèi)的動態(tài)變化，監(jiān)控副作用．

第三代基因編輯技術CRISPR/Cas9(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeat/associated 9)技術通過具有引導作用的單鏈RNA(Single Guide RNA, sgRNA)指導Cas9蛋白在與sgRNA互補處剪切雙鏈DNA，導致DNA雙鏈斷裂進而利用同源重組或非同源末端連接機制修復DNA并插入靶基因．CRISPR/Cas9技術具有高效、低毒性、低成本等優(yōu)勢，為快捷高效地對基因組進行編輯提供了條件．

AAVS1位點是位于人19號染色體上PPP1R12C基因第一個內(nèi)含子中的一段特定序列，在該區(qū)域內(nèi)引入外源核苷酸序列已被證明不會影響PPP1R12C基因或其他內(nèi)源基因的表達，并且對細胞的毒性小，是一個經(jīng)過驗證后確保插入靶基因正常轉(zhuǎn)錄且不影響鄰近基因表達的安全港位點[5]．AAVS1位點對DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)敏感，是一個開放的染色體結構[6]，同時與絕緣子樣順式作用元件相聯(lián)系，使得外源插入基因沉默的可能性最小化[7]．已證明，在hESCs的AAVS1位點轉(zhuǎn)入的靶基因可長期穩(wěn)定表達[8]．因此AAVS1位點可以作為生成含有三融合報告基因細胞株的有效位點．但是有文獻報道在AAVS1位點處EF1等啟動子有沉默現(xiàn)象[9]，因此本研究采用CRISPR/Cas9技術將兩種常用強啟動子(CAG和UB)啟動的3個報告基因(copGFP、Fluc和HSVttk)插入H7細胞株的AAVS1位點處，建成含有3個報告基因的H7細胞株(H7-TR)，同時對3個報告基因的表達進行了分析，進而比較不同啟動子對報告基因表達的影響，從而選出三融合報告基因高效、平衡表達的最優(yōu)載體結構，為后續(xù)干細胞移植策略的優(yōu)化提供了有效的多模態(tài)成像手段，并為人胚胎干細胞中基因表達的啟動子的選擇提供了實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9質(zhì)粒購自Addgene公司(Plasmid#42230)，pAAVS1-EF1由復旦大學生命科學學院王永明教授饋贈；大腸桿菌E.coliStbl3感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司．

1.2 方法

1.2.1 CRISPR載體

pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1靶向PPP1R12C第一個內(nèi)含子序列gggccactagggacaggat(圖1(a))．

圖1 pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1雙載體系統(tǒng)及供體質(zhì)粒敲入位點的設計Fig.1 Schematic diagram of CRISPR/Cas9 vector and CRISPR target site of donor vectors(a) 不同啟動子啟動的三融合報告基因結構圖；(b) CRISPR/Cas9介導干細胞AAVS1位點三融合報告基因敲入原理圖；DSB(double-strand breaks)，雙鏈斷裂；HR(homologous recombination)，同源重組．

首先，使用BsmBⅠ酶將sgRNA載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9進行酶切線性化，產(chǎn)生不同的黏性末端．根據(jù)酶切后的sgRNA載體的特點設計靶向序列引物AAVS1-sgRNA-F和AAVS1-sgRNA-R，由蘇州金唯智生物公司合成，引物序列見表1．將sgRNA的上下游進行變性、退火(60μL體系： 10μmol/L上下游引物各10μL+1.2μL 5mol/L NaCl，用去離子水定容到60μL；95℃，5min，自然冷卻至室溫)．用T4 DNA連接酶將退火的sgRNA上下游引物和線性化的sgRNA載體連接(10μL體系： 1μL退火產(chǎn)物+1μL sgRNA載體線性化產(chǎn)物+1μL T4 DNA連接酶+1μL T4 DNA連接酶緩沖液+6μL去離子水)，4℃過夜．轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Stbl3，Amp+平板篩選后，選取陽性克隆送去蘇州金唯智生物有限公司測序，測序引物Human-U6，如表1所示．將測序正確的菌落37℃搖床過夜培養(yǎng)，離心后收集菌體，按質(zhì)粒試劑盒說明書完成質(zhì)粒提取.

表1 引物列表

注： 下劃線處表示限制性內(nèi)切酶酶切位點．

1.2.2 供體質(zhì)粒構建

構建的H7-TR載體包括pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP、pAAVS1-UB-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP和pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-UB-copGFP(圖1(b))，都由pAAVS1-EF1衍生而來．

1.2.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

H7細胞培養(yǎng)于mTeSRTM1(STEMCELL Techonologies)完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2．本研究使用Thermo Fisher公司的Lipofectamine?3000 Transfecting Kit進行瞬時轉(zhuǎn)染的方法．H7細胞密度達到60%～70%時，用125μL mTeSRTM1基礎培養(yǎng)液加2.5μg pCRISPR/CAS9-sgRNA-AAVS1和2.5μg H7-TR質(zhì)粒后再加入5μL P3000TMreagent(Thermo Fisher)，充分混勻后與125μL mTeSRTM1基礎培養(yǎng)液稀釋的LipofecteminTM3000(Thermo Fisher)充分混勻，室溫孵育15min，加到事先準備的細胞中，37℃、5% CO2培養(yǎng)，48h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率．

1.2.4 穩(wěn)定細胞系的篩選

轉(zhuǎn)染48h后，維持1μg/mL嘌呤霉素篩選壓力下，每天更換新鮮培養(yǎng)液，37℃，5% CO2連續(xù)培養(yǎng)4d，經(jīng)500μL StemPro Accutase(Thermo Fisher)消化為單個細胞，在含1μg/mL嘌呤霉素的mTeSRTM1完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7～12d，挑取陽性克隆．

1.2.5 單克隆細胞基因型鑒定

用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN)提取傳代后單克隆的基因組．為了檢測供體質(zhì)粒是否插入到AAVS1位點，分別在供體質(zhì)粒和AAVS1位點設計5’端鑒定引物P1-AAVS1-LA(位于PPP1R12C基因第一個內(nèi)含子區(qū)，左側(cè)同源臂上游)和P2-AAVS1-LA(在供體質(zhì)粒Puro篩選基因內(nèi))，產(chǎn)物1051kb；3’端鑒定引物P3-AAVS1-RA(供體質(zhì)粒copGFP基因內(nèi))和P4-AAVS1-RA(右側(cè)同源臂下游)，產(chǎn)物長度為1023kb．引物序列如表1所示．PCR反應條件為： 95℃預變性5min；30個循環(huán)(94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min)；72℃后延伸7min．PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測．

1.2.6 螢光素酶報告基因檢測(啟動子活性)實驗(Luciferase Assay)

將構建成功的3個H7-TR細胞株培養(yǎng)于mTeSRTM1完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2．待細胞密度達到80%，吸走廢液，經(jīng)1mL DPBS洗2遍后，加入300μL PLB(Passive Lysis Buffer，Promega)，室溫，搖30min，將上述裂解液收集到1.5mL離心管中，1000g，4℃，離心10min，用BCA試劑和測出蛋白濃度，定量到1μg/mL，吸取10μL與96孔板中同時快速加入50μL螢光素酶檢測試劑Ⅱ(Promega)，用酶標儀檢測吸光值對螢火蟲螢光素酶(Firefly Luciferase，F(xiàn)luc)的活性定量．

1.2.7 流式細胞儀檢測

通過流式檢測copGFP強度和陽性細胞率．H7-TR細胞經(jīng)500μL StemPro Accutase(Thermo Fisher)，37℃消化1min，吸走消化液，DPBS洗兩遍，然后流式細胞儀鑒定copGFP陽性細胞的比率和強度．

1.2.8 丙氧鳥苷(Ganciclovir, GCV)敏感實驗

H7-TR細胞株培養(yǎng)于mTeSRTM1完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下連續(xù)培養(yǎng)2d后，在mTeSRTM1完全培養(yǎng)基中添加并維持10μmol/L GCV條件下，連續(xù)培養(yǎng)3d，顯微鏡觀察細胞狀態(tài)．

1.2.9 統(tǒng)計學分析

本實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，使用GraphPad 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組結果之間的比較采用t檢驗，設定P<0.05則具有統(tǒng)計學意義．(注：*P<0.05，**P<0.01，NSP>0.05)．

2 結 果

2.1 pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1載體和供體質(zhì)粒構建

為了克服人胚胎干細胞中病毒載體的基因沉默現(xiàn)象，我們設計了專門針對AAVS1位點的sgRNA，將其克隆到sgRNA載體中，命名為pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1．pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-UB-copGFP的鑒定見圖2(a)．

圖2 瓊脂糖凝膠電泳鑒定pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1及供體質(zhì)粒Fig.2 The detection for the vector pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1 and donor plasmid by agarose gel electrophoresis(a) PCR擴增產(chǎn)物的鑒定.1，2，3，4和5泳道分別是CAG、UB、Fluc-2A-Tk-2A-copGFP、UB-copGFP、AAVS1-EF1經(jīng)XbaⅠ和ClaⅠ雙限制性內(nèi)切酶的酶切結果；(b) 菌落PCR擴增產(chǎn)物的鑒定.1，2，3分別代表質(zhì)粒pAAVS1-UB-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP、pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP和pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-UB-copGFP.

具體步驟為： 利用CRISPR/Cas9技術形成雙鏈切口，利用同源重組，將不同啟動子驅(qū)動的Fluc、HSVttk和copGFP插入到AAVS1位點．利用引物CAG-ClaⅠ-F和CAG-XbaⅠ通過高保真酶擴增獲得CAG(1641bp)，通過同樣的方法，用引物UB-ClaⅠ和UB-XbaⅠ獲得UB(1236bp)，通過ClaⅠ和XbaⅠ雙限制性內(nèi)切酶進行酶切，連接到載體pAAVS1-EF1(6445bp)中，獲得載體pAAVS1-CAG和pAAVS1-UB．用引物FLuc-F-EcoRⅠ-F、FLuc-R-T2A-R、T2A-Tk-F、TK-P2A-R、P2A-CopGFP-F通過重疊PCR獲得Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP片段(3510bp)，用于構建pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP和pAAVS1-UB-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP；同理，利用引物FLuc-F-EcoRⅠ-F、FLuc-R-T2A-R、T2A-Tk-F、Tk-BamHⅠ-R獲得片段Fluc-T2A-Tk(2696bp)連接到載體pAAVS1-CAG中，獲得pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk；利用引物UB(ClaⅠ)-F、copGFP-SalⅠ-R通過普通PCR獲得片段UB-copGFP(1992bp)，連接到載體pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk中，成功構建pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-UB-copGFP(所用引物序列見表1)．轉(zhuǎn)化后每種載體取一個陽性克隆進行菌落PCR，所用引物為copGFP-F/R(表1)．圖2(b)結果顯示3種載體均為copGFP陽性．將菌落PCR鑒定為copGFP陽性的克隆送去測序，測序引物LucNrev(表1).

2.2 H7-TR細胞株篩選和鑒定

本研究使用LipofectaminTM3000轉(zhuǎn)染的方法將2.5μg目的質(zhì)粒(pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP，pAAVS1-UB-Fluc-T2A-Tk-P2A-copGFP和pAAVS1-CAG-Fluc-T2A-Tk-UB-copGFP)分別與2.5μg pCRISPR/Cas9-sgRNA-AAVS1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染H7細胞，構建H7-TR細胞株，分別命名為CTR(CAG-drived Triple Reporters)，UTR(UB-drived Triple Reporters)和CUTR(CAG and UB-drived Ttriple reporters)．經(jīng)1μg/mL 嘌呤霉素(Puro)連續(xù)篩選后挑取陽性單克隆進行基因型鑒定，結果3種H7-TR細胞株均在AAVS1位點成功插入三融合報告基因，3種細胞株均為雜合(圖3(a))．對其傳代后第一代(P1)進行熒光觀察，3種細胞株均全部表達copGFP，CUTR細胞株copGFP較強，CTR次之，UTR稍弱(圖3(b))．培養(yǎng)3d后加入10μmol/L 的HSVttk敏感試劑GCV，連續(xù)處理72h后細胞大多死亡，證明3種細胞系均成功表達HSVttk基因，且CTR對GCV較為敏感，UTR次之，而CUTR較弱(圖3(c))．螢光素酶報告基因檢測結果證明細胞株CTR中的Fluc表達強度高于UTR，CUTR細胞株Fluc表達強度較低(圖3(d))．

圖3 H7-TR細胞株的構建Fig.3 The construction of H7-TR cell line(a) 基因型鑒定，LA左臂1051bp；RA右臂1023bp；WT野生型1884bp；(b) H7-TR細胞株第一代copGFP熒光照片，標尺為100μm；(c) GCV敏感實驗： 10μmol/L GCV連續(xù)處理3d后，細胞生長狀況，標尺為200μm；(d) 螢光素酶報告基因檢測實驗，細胞株CTR中熒光素酶蛋白表達強度高于UTR，CUTR細胞株中表達強度較低；(e) 實時定量檢測細胞編輯后干細胞標記基因NANOGO、OCT4、SOX2表達水平；*P<0.05，**P<0.01，NSP>0.05.

實時定量分析結果證明3個細胞株CTR、UTR、CUTR干細胞標志基因OCT4、NANOGO、SOX2表達量均無顯著差異(圖3(e))．通過上述綜合分析證明CAG啟動子在AAVS1位點的表達活性強于UB啟動子，且采用雙啟動子并沒有提高相關基因的轉(zhuǎn)錄活性，總之CAG啟動的三融合報告基因最具優(yōu)勢．

2.3 細胞傳代對不同啟動子在AAVS1位點表達強度的影響

對3個細胞株進行連續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)現(xiàn)CTR細胞株熒光強度強于UTR細胞株，且無沉默現(xiàn)象(圖4(a))．流式檢測發(fā)現(xiàn)CTR細胞株熒光強度明顯強于UTR細胞株，驗證了熒光觀察的結果，且copGFP陽性率在90%以上(圖4(b)和(c))．同時跟蹤檢測Fluc基因表達水平，CTR細胞株Fluc表達強度最高，UTR次之，而CUTR細胞株最低(圖4(d))．通過連續(xù)跟蹤觀察，進一步證明在hESCs細胞的AAVS1位點處，CAG啟動子轉(zhuǎn)錄活性高于UB啟動子，且無沉默現(xiàn)象．此外發(fā)現(xiàn)含UB單啟動子的UTR細胞株中UB啟動的Fluc和copGFP報告基因有顯著沉默現(xiàn)象，而含CAG和UB雙啟動子的CUTR細胞株中由UB啟動的copGFP無顯著沉默現(xiàn)象，其具體機制還不清楚，推測與所載基因有關．

圖4 在AAVS1位點處CAG啟動子表達活性強于UBFig.4 The transcriptional activity of promoter CAG is stronger than that of UB promoter(a) H7-TR細胞株挑取陽性單克隆傳2代后(P2)和傳5代后(P5)copGFP熒光結果，標尺為100μm；(b)和(c) 流式分析copGFP表達情況，左側(cè)，為細胞株CTR P2和P5；中間，細胞株UTR P2和P5；右側(cè)，細胞株CUTR P2和P5；(d) 螢光素酶報告基因檢測實驗，H7-TR細胞株P2和P5代Fluc基因表達分析，*P<0.05，**P<0.01，NS P>0.05.

3 討 論

為了高效地示蹤移植細胞，通常選用多模態(tài)成像方式，這就需要多基因共同表達．為了保證多基因同水平共同表達，普遍采用融合蛋白的方式使其在同一個載體中共同表達，這種方式可保證多基因共同表達且不需要中介序列，然而有研究報道融合蛋白表達的方式可降低蛋白的表達活性，具有改變蛋白功能的危險[10-11]．而在多基因之間插入2A序列或2A類似序列能夠緩解這些問題[12]．本實驗主要采用2A序列連接三融合報告基因，排除了融合蛋白結構對蛋白活性帶來的影響．

AAVS1位點位于人類19號染色體PPP1R12C基因第一個內(nèi)含子中．在該區(qū)域內(nèi)引入外源基因已被證明不會影響PPP1R12C基因及其他內(nèi)源基因的表達，且對培養(yǎng)細胞無已知副作用．因此，理論上可以在此區(qū)段引入外源基因及其調(diào)控序列，以實現(xiàn)功能蛋白正常表達的目的．然而在不同細胞中，報告基因在AAVS1位點的表達及表達強度對啟動子具有很強的依賴性，例如CMV，EF1在hESCs細胞中容易發(fā)生沉默現(xiàn)象，而在HEK293細胞中卻又有較強的表達活性[13]．泛素啟動子UB啟動效率較高、甲基化程度相對較低、遺傳性狀穩(wěn)定，是目前研究較多的啟動子.用ZNF技術將三融合報告基因Fluc、RFP和HSVttk插入到AAVS1位點后，F(xiàn)luc并沒有沉默現(xiàn)象[14]．

2014年報道稱強啟動子CAG在AAVS1位點啟動的eGFP無論是在分化前還是分化后也都沒有沉默現(xiàn)象[9]．因此，為了高效表達多基因，我們選用強啟動子CAG和UB，構建了3種報告基因載體分別由CAG、UB及CAG和UB共同啟動自裂解多肽2A連接的三融合報告基因，通過CRISPR/Cas9技術，利用同源重組定向整合到人胚胎干細胞H7中的AAVS1位點，成功構建出CTR、UTR和CUTR 3個細胞株，并比較了其在AAVS1位點的表達活性．通過對3個細胞株進行連續(xù)跟蹤培養(yǎng)，熒光觀察和流式細胞儀檢測，發(fā)現(xiàn)CTR細胞株中CAG啟動的報告基因熒光強度強于UTR細胞株中UB啟動的，且無沉默現(xiàn)象，同時對Fluc跟蹤檢測發(fā)現(xiàn)CTR細胞株中CAG啟動的Fluc報告基因表達水平明顯高于UTR細胞株中UB啟動的，證明了CAG啟動子在AAVS1位點表達活性強于UB啟動子．此外通過熒光觀察和流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)CUTR細胞株中CAG和UB共同啟動的三融合報告基因中copGFP熒光強度明顯強于CTR和UTR細胞株中分別由CAG和UB單啟動子啟動的，但是Fluc活性檢測發(fā)現(xiàn)Fluc報告基因表達活性明顯低于CTR和UTR細胞株中分別由CAG和UB單啟動子啟動的，3個報告基因的表達出現(xiàn)了失衡現(xiàn)象，根據(jù)文獻報道這可能由雙啟動子之間相互干擾所致[15-16]．

綜上所述，本研究表明在AAVS1位點同時啟動基因時，CAG啟動子轉(zhuǎn)錄活性高于UB啟動子，且無明顯沉默現(xiàn)象，在構建過表達目的基因胚胎干細胞系時可優(yōu)先選用CAG啟動子．本研究構建的三融合報告載體系統(tǒng)可用于后續(xù)移植細胞的多模態(tài)成像，優(yōu)化移植策略．