李程 張境 王勇翔

200032上海,復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍的健康問題。據(jù)估計(jì)全球約有2.5億人罹患慢性乙型肝炎[1]。目前治療慢性乙肝的抗病毒藥物有干擾素α、PEG化干擾素α和核(苷)酸類似物等[2]。干擾素治療具有明顯的副作用；核苷酸類似物治療因停藥后出現(xiàn)病毒復(fù)制反彈而需長(zhǎng)期用藥，有病毒耐藥的風(fēng)險(xiǎn)[3]。因此，迫切需要開發(fā)新的抗HBV制劑。

HBV通過結(jié)合鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP)受體進(jìn)入肝細(xì)胞，核衣殼被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，核衣殼內(nèi)的松弛環(huán)狀 DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)被修復(fù)成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular，cccDNA)。 以cccDNA為模板，細(xì)胞RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄出5種HBV RNA，包括3.5 Kb編碼HBe抗原前體的precore RNA和編碼核心蛋白和聚合酶的前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)、2.4 Kb編碼 L蛋白的 mRNA、2.1 Kb編碼M和S蛋白的mRNA，0.7 Kb的編碼X蛋白的mRNA。HBV聚合酶結(jié)合pgRNA5’端莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)招募核心蛋白二聚體包裹pgRNA成核衣殼[4]。在核衣殼內(nèi)，HBV聚合酶以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈 DNA后，通過 RNaseH活性將pgRNA/負(fù)鏈DNA雙鏈中的pgRNA降解，再以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA。核衣殼在多囊泡體出芽并釋放出細(xì)胞[5]。

NEDD8是與泛素類似的蛋白。NEDD8在其活化酶(NEDD8 activating enzyme， NAE/E1)、結(jié)合酶(E2)，連接酶(E3)的催化下，將其羧基端第76位的甘氨酸與底物的賴氨酸共價(jià)結(jié)合，這一過程叫做NEDDylation。NEDDylation的底物主要是含 cullin的泛素連接酶(cullin-RING liagses，CRLs)[6]，參與調(diào)節(jié)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡。近年來研究表明NEDDylation還與病毒復(fù)制有關(guān)。皰疹病毒、腺病毒和流感病毒通過NEDDylation激活CRLs而促進(jìn)病毒復(fù)制[7-8]；一些RNA病毒(如仙臺(tái)病毒、水皰性口炎病毒等)通過 CRLs相關(guān)的 UPS促進(jìn)干擾素調(diào)節(jié)蛋白-3(interferon regulatory factor 3，IRF3)降解而干擾抗病毒先天性免疫反應(yīng)[9-10]。近年來研究還發(fā)現(xiàn)存在不依賴CRLs的NEDDylation[11]，提示NEDD8可能具有額外的生物學(xué)功能。目前關(guān)于細(xì)胞NEDDylation在HBV復(fù)制中的作用仍不清楚。本研究采用NAE特異性抑制劑 MLN4924抑制細(xì)胞CRLs和其他一些底物的NEDDylation，檢測(cè)HBV復(fù)制和HBV pgRNA包裝效率。

1 材料與方法

1.1 材料 pCH-9/3091質(zhì)粒由德國(guó)弗賴堡大學(xué)Michael Nassal教授提供，包含D基因型的HBV基因組(GenBank登記號(hào)V01460)。為檢測(cè)包裝入核衣殼的pgRNA，本研究構(gòu)建了HBV聚合酶失活變異體表達(dá)質(zhì)粒pCH-9/3091-YMHD:以pCH-9/3091質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將聚合酶催化中心YMDD基序基因突變?yōu)閅MHD基因而獲得HBV聚合酶失活變異體pCH-9/3091-YMHD，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后，pgRNA可被包裝入核衣殼，但不能合成負(fù)鏈DNA，pgRNA也不被降解，因此核衣殼內(nèi)的HBV核酸為pgRNA。將 HBV核心蛋白基因擴(kuò)增后克隆入pCDNA6載體獲得pCDNA-core質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后，細(xì)胞雖然產(chǎn)生了大量核心顆粒，但用HBV特異的探針作雜交發(fā)現(xiàn)這些顆粒不包裝任何HBV特異的核酸，用作對(duì)照。Huh-7細(xì)胞和四環(huán)素調(diào)控且穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepAD38細(xì)胞為本室保存。MLN4924購自 MedChemExpress公司，胎牛血清購自Gibco公司，DMEM培養(yǎng)液和核酸預(yù)雜交液購于ThermoFisher Scientific公司，隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒購自Roche公司，α-32P-dGTP購于Perkin-Elmer公司。實(shí)驗(yàn)中所用抗體及來源如下:anti-core多克隆抗體(Dako公司)，anti-core單克隆抗體由張繼明教授(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院)饋贈(zèng)，actin單克隆抗體和gpr78多克隆抗體(Proteintech公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗(Jackson ImmunoResearch公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):Huh-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。HepAD38細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中額外添加200μg/ml G418抗生素，在相同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，不含四環(huán)素的培養(yǎng)液培養(yǎng)使pgRNA轉(zhuǎn)錄而起始HBV復(fù)制，每2～3 d傳代。

1.2.2 DNA轉(zhuǎn)染:計(jì)數(shù)3.0×105個(gè)Huh-7細(xì)胞鋪于6孔板中，18～24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取250μl opti-MEM，加入質(zhì)粒 DNA 2.5μg，混勻后加入7.5μl TransIT-LT1轉(zhuǎn)染試劑，混勻后靜置15 min。將混合物均勻滴加到已更換新鮮培養(yǎng)液的6孔板中。

1.2.3 藥物處理:向HepAD38細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入梯度濃度的MLN4924，并用不同濃度的HBV聚合酶抑制劑 LAM作對(duì)照，每 3 d更換1次含MLN4924或LAM的培養(yǎng)基，加藥后第6天用NP40裂解緩沖液裂解細(xì)胞；向轉(zhuǎn)染了pCH-9/3091-YMHD的Huh-7細(xì)胞中添加MLN4924(終濃度為0.1 μmol/L)，并添加DMSO作為對(duì)照(MLN4924溶于DMSO)，每3 d更換1次含MLN4924或DMSO的培養(yǎng)基，加藥后第6天裂解細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)病毒核衣殼檢測(cè):利用非變性瓊脂糖凝膠電泳(native agarose gel electrophoresis，NAGE)分離HBV核衣殼:NP40裂解液裂解細(xì)胞，細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜和HBV包膜破裂，核衣殼釋放出來。裂解液經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠分離，衣殼顆粒在電場(chǎng)的作用下向正極遷移。隨后用免疫印跡檢測(cè)核衣殼:通過虹吸轉(zhuǎn)膜裝置將衣殼顆粒轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，5%脫脂奶粉封閉后與anti-core多克隆抗體孵育，TBST漂洗后與 HRP標(biāo)記的二抗孵育，用化學(xué)發(fā)光液(chemiluminescence， ECL)檢測(cè)。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和免疫印跡:細(xì)胞樣品用含SDS的樣品緩沖液處理，100℃變性10 min。配制4.5%濃縮膠和12.5%分離膠進(jìn)行電泳。電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，按照1.1.3所述方法檢測(cè)蛋白。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)HBV DNA提取:取一定量細(xì)胞裂解上清加入DNase I 37℃消化處理30 min，再加入蛋白酶K 53℃消化釋放病毒基因組，最后經(jīng)酚/氯仿抽提和DNA沉淀獲得HBV DNA。

圖1 MLN4924劑量依賴地抑制HepAD38細(xì)胞HBV DNA復(fù)制A.According to the different detection methods， the results were divided into three parts:NAGE， Southern blot and Western blot.HepAD38 Cells were incubated with various concentrations of MLN4924 and lamivudine for 6 days.Intracellular capsids were analyzed by NAGE， capsid associated viral DNAs by Southern blot， and viral and cellular proteins by Western blot；B.Graphic presentation of HBV replication marker levels at the treatment of increasing concentrations of MLN4924Fig.1 MLN4924 inhibited HBV DNA replication in a dose-dependent manner in HepAD38 cells

1.2.7 Southern blot檢測(cè)病毒 DNA復(fù)制:HBV DNA樣品經(jīng)1%的NAGE分離；變性液和中和液分別處理凝膠45 min后，通過虹吸轉(zhuǎn)膜裝置將病毒DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上；尼龍膜80℃烤膜固定；預(yù)雜交液42℃孵育30 min；用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒標(biāo)記探針；將變性后的摻入32P標(biāo)記的dGTP的DNA探針加入預(yù)雜交液中42℃雜交過夜；洗膜后磷屏曝光，最后用多功能生物分子成像儀掃描磷屏記錄的信號(hào)并成像。

1.2.8 原位檢測(cè)核衣殼中DNA:1.2.4中經(jīng)NAGE分離和免疫印跡檢測(cè)的核衣殼在80℃烤箱中烘烤2 h，使衣殼顆粒固定在尼龍膜上，DNA變性液處理5 min，中和液處理5 min；再用1.2.6所述方法檢測(cè)顆粒內(nèi)的病毒DNA。

1.2.9 原位檢測(cè)核衣殼中RNA:相關(guān)溶液均用DEPC水配制，檢測(cè)方法同1.2.7。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理:利用 FUJIFILM公司的 Multi Gauge V2.2軟件對(duì)蛋白、DNA及RNA信號(hào)進(jìn)行灰度掃描；利用數(shù)據(jù)處理軟件Origin 8.0進(jìn)行折線圖的繪制；兩組數(shù)據(jù)均數(shù)的比較采用Student-t檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLN4 924劑量依賴地抑制HBV DNA復(fù)制Western blot結(jié)果顯示0.1～20μmol/L LAM和0.01～2μmol/L MLN4924對(duì)actin和GRP78蛋白的表達(dá)無明顯影響(圖1A，Western blot)，提示高達(dá)20 μmol/L拉米夫定和2μmol/L MLN4924不引起細(xì)胞毒性。Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核心蛋白，NAGE-免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)核衣殼，結(jié)果顯示LAM不改變核心蛋白的表達(dá)和核衣殼的形成，而MLN4924能輕度劑量依賴地減少核心蛋白和核衣殼(圖1A，Western blot和NAGE)。Southern blot和原位病毒DNA檢測(cè)結(jié)果顯示LAM和MLN4924都能顯著地且劑量依賴地減少核衣殼相關(guān)病毒DNA(圖1，Southern blot和NAGE)?；叶葤呙杞Y(jié)果顯示，隨著MLN4924濃度增高，actin的量無明顯變化，核心蛋白和核衣殼變化趨勢(shì)一致，Southern blot和NAGE原位檢測(cè)病毒DNA結(jié)果一致(圖1B，Southern blot和NAGE)，且隨著MLN4924濃度增加，核衣殼中病毒DNA下降幅度顯著高于核衣殼(圖1A，capsid和DNA；圖1B)，這提示HBV pgRNA包裝或下游DNA合成可能被抑制。

2.2 MLN4924抑制HBV pgRNA包裝 pCDNA-core轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后，細(xì)胞產(chǎn)生了大量核心顆粒(圖2A，capsid)，但HBV特異的探針作雜交結(jié)果顯示顆粒中不包裝任何HBV特異的核酸(圖2A，pgRNA)。pCH-9/3091-YMHD轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞后，細(xì)胞也產(chǎn)生了大量的核心顆粒(圖2A，capsid)，而且這些顆粒包裝了pgRNA(圖2A，pgRNA)。當(dāng)用核心顆粒的量作校正后，發(fā)現(xiàn)0.1μmol/L MLN4924使核衣殼包裝的pgRNA減少至DMSO對(duì)照組的53.4%(圖2B)，而相同濃度的MLN4924也使衣殼相關(guān)病毒 DNA減少至對(duì)照組的56.6%(圖1B)。因此MLN4924可能通過抑制pgRNA包裝而減弱HBV復(fù)制。

圖2 MLN4924抑制HBV pgRNA的包裝A.Huh-7 cells were respectively transfected with pCH-9/3091-YMHD or pCDNA-core plasmids，then incubated with MLN4924 or vehicle-DMSO.Cytoplasmic capsids and capsid-associated RNA were sequentially detected with NAGE-immunoblotting and hybridization with 32 P labeled HBV specific DNA probes；B.Graphic presentation shows that relative pgRNA encapsidation efficiency by normalizing the amount of packaged pgRNA with that of capsids.NS:Not significant， ?P ＜0.05 Fig.2 MLN4924 inhibited pgRNA encapsidation

3 討論

本研究采用NAE抑制劑-MLN4924干擾細(xì)胞內(nèi)蛋白NEDDylation修飾反應(yīng)。MLN4924輕度劑量依賴地抑制核心蛋白的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)NEDDylation修飾HBV X蛋白(HBx)后可阻止HBx通過泛素化途徑降解[12]，從而促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄激活[13]。NAE抑制劑MLN4924抑制HBx NEDDy lation，HBx降解增多，其促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄作用減弱，從而導(dǎo)致編碼核心蛋白的pgRNA減少。

MLN4 924劑量依賴地減弱pgRNA包裝和HBV DNA復(fù)制，而且兩者下降程度相近。HBV DNA復(fù)制是 pgRNA包裝入核衣殼的后續(xù)步驟，因此MLN4924通過抑制pgRNA包裝而減弱HBV DNA復(fù)制。pgRNA包裝是個(gè)復(fù)雜的過程。在宿主因子如HSP90等的幫助下，HBV聚合酶識(shí)別并結(jié)合pgRNA，再招募核心蛋白二聚體組裝成核衣殼，如果NEDDylation修飾上述病毒或宿主蛋白，或修飾其他未知宿主因子而調(diào)節(jié)pgRNA包裝，則像MLN4924這樣的NEDDylation抑制劑將抑制pgRNA包裝。因此，本研究還將檢驗(yàn) HBV聚合酶、核心蛋白和HSP90是否為NEDDylation的底物，這將有助于進(jìn)一步了解HBV復(fù)制機(jī)理。

利益沖突 無