許維娜，耿常樂，任同同，孔祥君

（1. 濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院葡萄酒學(xué)院，山東煙臺 264003；2. 煙臺張裕集團(tuán)有限公司/山東省葡萄酒微生物發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，山東煙臺 264001；3. 煙臺邁百瑞國際生物醫(yī)藥有限公司，山東煙臺 264006）

葡萄酒發(fā)酵過程中，酵母菌的種群組成及變化對葡萄酒的風(fēng)味和品質(zhì)有重要影響[1]。采用多種酵母菌混合發(fā)酵，不同于單一酵母菌發(fā)酵，能使發(fā)酵產(chǎn)品表現(xiàn)出更好的特性，如增加酒體的復(fù)雜度等[2]。混菌發(fā)酵過程中，各種酵母或者代謝產(chǎn)生一些有益的風(fēng)味化合物如高級醇、酯類等，或者降解某些異味物質(zhì)如乙酸、乙醛等，或者促進(jìn)其他酵母的代謝性能，從而最終改變發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味特征，使發(fā)酵出來的葡萄酒風(fēng)味更佳豐富、濃郁[3-6]。綜合說來，混菌發(fā)酵并不是兩種微生物的簡單混合，在發(fā)酵中各菌種會產(chǎn)生明顯的互補增效作用，大大提高產(chǎn)品質(zhì)量。目前，混菌發(fā)酵在葡萄酒行業(yè)普及程度低，具有極大的開發(fā)前景。

目前，葡萄酒混菌發(fā)酵的相關(guān)研究多采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）與非釀酒酵母（non-Saccharomyces）混合發(fā)酵，如趙賓賓[7]采用釀酒酵母與淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）混合發(fā)酵，韓姍姍[8]采用釀酒酵母與檸檬形克勒克氏酵母（Kloeckera apiculata）混合發(fā)酵，Moreira等[9-10]采用釀酒酵母與葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）混合發(fā)酵。非釀酒酵母雖然發(fā)酵風(fēng)味較好，但發(fā)酵產(chǎn)品也存在一些隱患，如食品安全問題等。

本研究選擇兩株釀酒酵母（速度型發(fā)酵菌株和風(fēng)味型發(fā)酵菌株）進(jìn)行混合發(fā)酵，考察不同接種比例對發(fā)酵產(chǎn)品感官特性和風(fēng)味物質(zhì)的影響，探索最適合的發(fā)酵比例，為葡萄酒發(fā)酵工藝的優(yōu)化提供了一種有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

釀酒酵母S2，速度型發(fā)酵菌株，本實驗室2016年分離自大柳行葡萄基地；釀酒酵母F6，風(fēng)味型發(fā)酵菌株，本實驗室2016年分離自大澤山某葡萄基地；釀酒葡萄‘蛇龍珠’取自煙臺蓬萊某葡萄園，除梗破碎后取汁。

1.2 主要試劑和設(shè)備

蛋白胨、酵母粉，英國OXFID公司；葡萄糖、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；斐林A液、斐林B液，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；3-辛醇、氬氣，山東天海有限公司。

Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計，安捷倫科技公司；臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；TSQ8000Evo氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo公司；附溫度計密度瓶，上海壘固儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄酒酵母的活化與濃度測定

將釀酒酵母S2和F6接種到Y(jié)EPD液體培養(yǎng)基中，于28℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。按5%的接種量接種至葡萄汁液體培養(yǎng)基，相同條件下振蕩培養(yǎng)24 h，重復(fù)1次，得到活化的野生葡萄酒酵母。

活化后的酵母適度稀釋后，紫外分光光度法測量其吸光度值（OD600），計算酵母菌濃度，以此為依據(jù)計算接種量。計算公式：酵母菌濃度/(個/mL)＝OD600×稀釋倍數(shù)×107。

1.3.2 接種與發(fā)酵

共設(shè)7個試驗樣品，其中S2與F6的接種比例分別為6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6（樣品1～7），S2和F6單獨接種作為對照（樣品8、9）。24～26 ℃進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)酵開始后，每天監(jiān)測比重、溫度、CO2、失重量，重量、比重基本不發(fā)生變化時結(jié)束發(fā)酵。發(fā)酵液低溫澄清后進(jìn)行倒罐，轉(zhuǎn)入新的發(fā)酵罐低溫儲藏。

1.3.3 葡萄酒的理化指標(biāo)檢測

葡萄酒的總糖與還原糖測定采用斐林滴定法，總酸的測定用酸堿滴定法，酒精度的測定用密度瓶法[11]。

1.3.4 香氣成分檢測

利用頂空固相微萃取法進(jìn)行香氣富集，氣相色譜-質(zhì)譜法檢測香氣物質(zhì)，參考李凱等[12]方法。取5 mL酒樣于萃取瓶中，加入轉(zhuǎn)子和1.5 g NaCl、200 μL 3-辛醇，50 ℃水浴預(yù)平衡10 min，將活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分萃取50 min，將進(jìn)樣器插入進(jìn)樣口10 min進(jìn)行測樣。GC-MS法分析測得的香氣物質(zhì)的峰面積及出現(xiàn)時間，通過對比3-辛醇的面積及濃度計算該香氣物質(zhì)的濃度。色譜柱為CP-WAX57CB，進(jìn)樣量10 μL，色譜條件是載氣流速0.8 mL/min，空氣流速300 mL/min，分流比30∶1，進(jìn)樣口溫度250 ℃。

1.3.5 感官評價

參照GB/T 15038—2006[13]中香氣評價方法，由15位品酒員組成感官評價小組，對不同比例的酵母釀造的葡萄酒分別從外觀（20分，包括澄清度及掛杯性10分、色澤10分）、香氣（40分，包括風(fēng)味特征20分、協(xié)調(diào)性20分）、口感（40分，包括口感特性20分、協(xié)調(diào)性20分）三個方面進(jìn)行感官評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)分析

如表1所示。所有樣品的殘?zhí)嵌荚? g/L以下，酒精度在11.04～12.89 %vol，總酸在4.01～4.25 g/L?；炀l(fā)酵樣品普遍糖含量較低，糖利用程度較高。S2單獨發(fā)酵的樣品酒精度最高，其糖耗主要進(jìn)行酒精發(fā)酵；F6單獨發(fā)酵的樣品酒精度最低；混菌發(fā)酵樣品的酒精度介于兩者之間。

表1 發(fā)酵樣品理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of fermented samples

2.2 香氣物質(zhì)檢測結(jié)果

通過頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜方法對葡萄酒香氣成分進(jìn)行分析，共檢測出56種香氣成分，按照結(jié)構(gòu)特性將56種香氣物質(zhì)分為酯類（表2）、醇類（表3）、酸類（表4）、羰基化合物（表5）、萜烯醇類（表6）六大類。從表中可以看出，不同比例接種的酒樣所含的香氣物質(zhì)不同，香氣物質(zhì)中以醇類和酯類物質(zhì)為主，酯類種類最多，醇類和酸類次之，羰基化合物、萜烯醇類在總含量中所占比例很小。

如表2所示，各樣品中共鑒定出酯類香氣物質(zhì)24種，其中單菌發(fā)酵的酒樣中擁有21種，表明混菌發(fā)酵過程中，不同菌株互相激發(fā)和促進(jìn)，產(chǎn)生了更多的香氣物質(zhì)。酯類中，辛酸乙酯含量最高，濃度在3.4～4.6 g/L，其他酯類香氣癸酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、月桂酸乙酯和十六酸乙酯相對含量也較高，這些酯類在葡萄酒中主要貢獻(xiàn)的香氣類型是蘋果、草莓等果香。酯類物質(zhì)含量最高的為樣品9（風(fēng)味型菌株F6單獨發(fā)酵），其次為樣品6（S2∶F6=1∶4）。

如表3所示，各樣品中共鑒定出醇類香氣物質(zhì)12種，其中除了乙醇含量最多外，3-甲基丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇和己醇所占比例也較高。醇類物質(zhì)呈現(xiàn)的除了酒精獨特的香味外，還有青草味、玫瑰花香、香料、苦杏仁味等，貢獻(xiàn)的主要是植物類香氣。醇類物質(zhì)含量最高的樣品為樣品8（速度型菌株S2單獨發(fā)酵），而且速度發(fā)酵菌株比例較高的樣品中，醇類物質(zhì)含量也較高。

如表4所示，酸類中含量較高的有辛酸、正癸酸、乙酸和癸烯酸。辛酸是一種低級脂肪酸，它具有干酪味和粗獷味。然而，它在整個酒結(jié)構(gòu)中起著重要的作用，并能抑制芳香酯的水解，因此對于香氣平衡具有重要作用。高含量（大于20 mg/L）的C8～C10脂肪酸會表現(xiàn)不良風(fēng)味，然而低含量可以帶來令人愉悅的氣味[14-15]。本研究中辛酸的濃度范圍為1.32～1.70 mg/L，會對整體香氣產(chǎn)生良好的影響。酸中其他物質(zhì)呈現(xiàn)為不愉悅的香氣如腐敗味、醋味、黃楊木味等，但含量相對較低，對香氣影響較小。

如表5所示，羰基化合物中的大馬酮含量相對較高，它具有強烈干果香氣，增強了葡萄酒的特征香氣[16]。樣品9中羰基化合物含量最高。

如表6所示，萜烯醇類物質(zhì)中的里哪醇和橙花醇、橙花叔醇香氣突出，它們主要來源于葡萄果實，在葡萄酒的發(fā)酵和儲藏過程中很少或不發(fā)生改變，是形成品種香氣的重要化合物[17-20]。樣品6中萜烯醇類物質(zhì)含量最高。

2.3 感官品評結(jié)果

表2 酒樣中脂類物質(zhì)含量 （單位：g/L）Table 2 Contents of esters in wine samples (Unit: g/L)

表3 酒樣中醇類物質(zhì)含量 （單位：g/L）Table 3 Contents of alcohols in wine samples (Unit: g/L)

表4 酒樣中酸類物質(zhì)含量 （單位：g/L）Table 4 Contents of acids in wine samples (Unit: g/L)

表5 酒樣中羰基化合物含量 （單位：g/L）Table 5 Contents of carbonyl compounds in wine samples (Unit: g/L)

表6 酒樣中萜烯醇類化合物含量 （單位：g/L）Table 6 Contents of terpene alcohols in wine samples (Unit: g/L)

將15名品評員的品評數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如圖1所示。樣品6（S2∶F6＝1∶4）得分最高，表現(xiàn)為較明顯的果香和發(fā)酵香，香氣平衡，酒體豐滿。相對而言，速度發(fā)酵菌株比例較大的樣品中，奶酪、肥皂的氣味較濃，香氣和口感不佳，這主要是因為酵母發(fā)酵使二類香氣比例變大，掩蓋了一類香氣，從而降低了葡萄酒的質(zhì)量。

綜合香氣物質(zhì)分析和感官品評結(jié)果，認(rèn)為樣品6為最佳樣品，即速度發(fā)酵酵母與風(fēng)味發(fā)酵酵母接種比例為1：4時酒的質(zhì)量最好。

3 結(jié)論

本研究將速度發(fā)酵酵母與風(fēng)味發(fā)酵酵母按照不同的比例接種到‘蛇龍珠’葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，對發(fā)酵液進(jìn)行理化指標(biāo)和香氣物質(zhì)檢測，并進(jìn)行感官品評，探索混合發(fā)酵中接種比例對葡萄酒質(zhì)量的影響。

研究結(jié)果表明，單一菌株發(fā)酵的葡萄酒有明顯的果香但香氣較為單一，有些香氣物質(zhì)相較于混菌發(fā)酵來說含量較少甚至沒有，混合發(fā)酵對于葡萄酒香氣復(fù)雜度的提升有重要意義。速度發(fā)酵菌和風(fēng)味發(fā)酵菌的接種比例為1∶4時釀造的葡萄酒風(fēng)味最好，發(fā)酵產(chǎn)品呈現(xiàn)出明顯的品種香氣和清新的果香和淡花香。相對比例較高的風(fēng)味型酵母會使葡萄酒在發(fā)酵過程中形成的發(fā)酵香氣更為復(fù)雜、濃郁，但如果風(fēng)味型酵母的比例過高，則會使發(fā)酵香氣掩蓋一類香氣，使葡萄酒整體呈現(xiàn)奶酪味、肥皂味等不良?xì)馕?，因此過于追求發(fā)酵類香氣并不能使葡萄酒的氣味更加豐富，而會導(dǎo)致整體酒香失衡從而使葡萄酒質(zhì)量變差。

本研究探索了接種不同比例的兩種釀酒酵母對葡萄酒質(zhì)量的影響，后期可以在不同比例的基礎(chǔ)上，嘗試進(jìn)行順序發(fā)酵，繼續(xù)優(yōu)化混菌發(fā)酵工藝，利用混菌發(fā)酵釀造更具風(fēng)味的優(yōu)質(zhì)葡萄酒。

圖1 感官分析雷達(dá)圖Figure 1 Radar map of sensory analysis