朱豐 吳端生

[摘要] 目的 建立實驗紅鯽C1HD系的SNP標記。 方法 參照斑馬魚的SNPs基因庫，設(shè)計SNP引物，采用單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U增（SB-ASA）方法，對12尾實驗紅鯽C1HD系和12尾實驗紅鯽封閉群的血液DNA樣品進行SNPs基因分型并測序驗證。 結(jié)果 zK261O7基因的zSNP30124211位點（G/A型）、zC227H20基因的zSNP24678043位點（A/T型）和zC39F23基因的zSNP26474328位點（G/C型）等3個SNPs位點能夠準確辨別實驗紅鯽C1HD系和實驗紅鯽封閉群。 結(jié)論 zSNP30124211位點（G/A型）、zSNP24678043位點（A/T型）和zSNP26474328位點（G/C型）均可作為實驗紅鯽C1HD系的SNPs標記。

[關(guān)鍵詞] 實驗紅鯽；C1HD系；單核苷酸多態(tài)性；單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U增

[中圖分類號] Q95-33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）07（a）-0004-04

Establishment of SNPs markers of the laboratory red crucian carp C1HD strain

ZHU Feng1 WU Duansheng2

1.Endocrinology Division， the Affiliated Hospital of Jinggangshan University， Jiangxi Province， Ji′an 343009， China； 2.Department of Laboratory Animal Science，University of South China， Hu′nan Province， Hengyang 421001， China

[Abstract] Objective To establish SNP markers of the laboratory red crucian carp C1HD strain. Methods SNPs primers were designed referring to SNPs gene library of the Zebrafish， the SNPs were genotyped by single-tube bi-directional allele-specific amplification （SB-ASA） and were verified by sequencing for the laboratory red crucian carp C1HD strain. Results SNPs-PCR of blood DNA samples of laboratory red crucian carp could be genotyping of three sites Zk261O7 gene zSNP30124211 （G/A type）， zC227H20 gene zSNP24678043 （A/T type） and zC39F23 gene zSNP26474328（G/C type）. These three SNP markers were able to accurately identify the laboratory red crucian carp C1HD strain and the laboratory red crucian carp closed colony. Conclusion Three SNPs markers of Zk261O7 gene loci zSNP30124211 （G/A type）， zC227H20 gene loci zSNP24678043 （A/T type） and zC39F23 gene loci zSNP26474328（G/C type） could be used as SNPs markers in the laboratory red crucian carp.

[Key words] Laboratory red crucian carp； C1HD strain； Single nucleotide polymorphism； Single-tube bi-directional allele specific amplification

分布于我國長江流域的紅鯽（Carassius auratus red variety）屬鯽（Carassius auratus）的變種，它具有許多作為實驗動物開發(fā)的優(yōu)點[1]。本實驗室培育出了實驗紅鯽C1HD系，是目前國內(nèi)外唯一的一種實驗紅鯽近交系，可用于水生態(tài)毒理學(xué)等實驗研究和環(huán)境安全性評價，本實驗室已對它的一般生物學(xué)特性進行了研究[1-2]。實驗紅鯽C1HD系作為一種實驗魚類，應(yīng)該建立它的遺傳標記，以便用于對它進行遺傳質(zhì)量監(jiān)測。

建立DNA分子遺傳標記是目前實驗動物培育及其遺傳質(zhì)量檢測方法研究的發(fā)展方向[3-7]。早先，本實驗室曾對實驗紅鯽C1HD系的隨機擴增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、微衛(wèi)星多態(tài)性（SSR）等DNA分子標記進行過研究[8-9]?；趩魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）標記具有快速、可靠、費用低以及高置信度的優(yōu)點[3，10]和既往研究中對大小鼠SNP標記研究的成功經(jīng)驗[11-15]，本文也采用單管雙向等位基因?qū)Ｒ恍詳U增（single-tube bi-directional allele specific amplification，SB-ASA）方法來建立實驗紅鯽C1HD系的SNP標記，為編制實驗紅鯽C1HD系遺傳質(zhì)量控制標準提供技術(shù)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

普通級實驗紅鯽C1HD系，12尾，4年齡，平均體重41.2 g，設(shè)為A組。普通級實驗紅鯽封閉群，12尾，4年齡，平均體重45.6 g，設(shè)為B組；均由本實驗室提供，隨機取樣。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

蛋白酶K溶液（10 mg/mL），購自北京天根公司；瓊脂糖（Agarose），Spanish分裝；6×DNA loading buffer，購自碧云天公司；λ/HindⅢ、50 bp ladder、MarkerⅠ、1kb ladder plus等DNA Marker，購自北京天根公司；2×Taq PCR MasterMix，購自北京天根公司；引物，上海生工公司合成；多功能DNA純化回收試劑盒，百泰克公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy Vector System，購自Promega公司；T4 DNA Ligase，購自Fermentas公司；EcoR Ⅰ酶，購自Fermentas公司；大腸埃希菌JM109菌種，購自寶生物（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，購自O(shè)xoid公司。

-20℃冰箱，海爾公司產(chǎn)品；-80℃超低溫冰箱，HARRIS公司產(chǎn)品；高速離心機，SORVALL公司產(chǎn)品；梯度PCR儀，Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon公司產(chǎn)品。

1.3 基因組DNA的提取與檢測

從實驗紅鯽尾靜脈抽取全血，直接進行DNA提取，并置于-80℃超低溫冰箱保存。基因組DNA的提取參照標準酚-氯仿抽提法進行[16]。用微量核酸蛋白檢測儀結(jié)合0.7%瓊脂糖凝膠電泳對DNA純度和濃度進行檢測。

1.4 引物設(shè)計

從斑馬魚SNPs數(shù)據(jù)庫[17]和NCBI數(shù)據(jù)庫dbSNP[18]隨機選擇若干個SNPs，利用Primer Premier 5.0軟件，根據(jù)其位點兩側(cè)序列來設(shè)計引物P1、P2、MSP1、MSP2。其中引物MSP1、MSP2的3′端倒數(shù)第3位人為引入一個錯配堿基，以增加SNP檢測的精確性。經(jīng)過篩選后，確認4種有效引物（表1）。

1.5 SNP-PCR檢測

1.5.1 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)體系總體積25 μL，依次加入：ddH2O，8 μL；2× Taq PCR Master Mix，12.5 μL；引物（20 μmol/L），各0.5 μL；特異性引物（20 μmol/L），各0.75 μL；DNA模板，2 μL。

PCR反應(yīng)程序為：94℃（預(yù)變性），3 min，1個循環(huán)；94℃（變性），30 s；退火溫度51.7～60.5℃，30 s，30個循環(huán)；72℃（延伸），1 min；72℃（延伸），5 min，1個循環(huán)。4℃保存。

1.5.2 電泳 將事先配置好的1.5%瓊脂糖固體凝膠放入0.5×TBE電泳緩沖液的水平電泳槽中，PCR產(chǎn)物分別混合6×DNA loading buffer稀釋至1×DNA loading buffer后分別加入瓊脂糖凝膠點樣孔，80 V電壓下電泳50 min～1 h，在Tanon GIS system上觀察、拍照。

1.6 PCR產(chǎn)物測序

采用多功能DNA純化回收試劑盒，目的片段的純化回收按試劑盒說明書進行。連接pGEM-T Easy Vector，以大腸埃希菌JM109細胞進行電轉(zhuǎn)化。提取質(zhì)粒DNA，酶切鑒定，菌液送上海生工基因有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖譜，以斑馬魚zSNP30124211等位基因（G/A型）設(shè)計的引物，在實驗紅鯽C1HD系中擴增出了314 bp的特異條帶，基因型為G；而在實驗紅鯽封閉群中擴增出了153 bp的特異條帶，基因型為A（圖1）。以斑馬魚zSNP24678043等位基因（A/T型）設(shè)計的引物，在實驗紅鯽C1HD系中擴增出了289 bp的特異條帶，屬于基因型A；而在實驗紅鯽封閉群中擴增出了228 bp的特異條帶，屬于基因型T（圖2）。以斑馬魚zSNP26474328等位基因（G/C型）設(shè)計的引物，在實驗紅鯽C1HD系中擴增出了141 bp的特異條帶，屬于基因型G；而在實驗紅鯽封閉群中擴增出了254 bp的特異條帶，屬于基因型C（圖3）。以斑馬魚zSNP16713301等位基因（C/T型）設(shè)計的引物，在實驗紅鯽C1HD系和封閉群中均擴增出了1條311 bp大小的條帶，屬于基因型C；而在實驗紅鯽封閉群中還擴增出了226 bp的特異條帶，屬于基因型T（圖4）。歸納起來，實驗紅鯽C1HD系和封閉群4個SNP等位基因位點的基因型見表2。

2.2 測序驗證結(jié)果

對zK261O7基因zSNP30124211（G/A類型）、zC2-27H20基因zSNP24678043（A/T類型）和zC39F23基因zSNP26474328（G/C類型）等三個位點的基因序列測序的結(jié)果與SB-ASA方法檢測的結(jié)果完全一致。

3 討論

作為第三代DNA分子標記，SNP具有遺傳穩(wěn)定性高、位點豐富、分布廣泛、適于快速、規(guī)?；Y查、易于估計等位基因頻率和進行基因型確定等優(yōu)點[3，10，19-20]。有研究表明，具有種群特異性的SNP標記是能夠遺傳的，故現(xiàn)在被當(dāng)做常用的遺傳標記研究對象[21]。Msalya等[22]就將SNP標記用于研究鑒別坦桑尼亞土著短角牛種群（TSZ）中的3個品系。其實，Petkov等[10]很早就將在SNP標記嘗試用于實驗小鼠的遺傳檢測?，F(xiàn)在已逐漸將SNP標記廣泛用于實驗動物的遺傳檢測[3-5，7，12-15]。本文發(fā)現(xiàn)有3個SNPs位點，即zSNP30124211、zSNP24678043和zSNP26474328位點，可以準確區(qū)分實驗紅鯽C1HD系和實驗紅鯽封閉群，故可作為實驗紅鯽C1HD系的SNP標記。

關(guān)于SNPs檢測的方法很多，如單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、變性梯度凝膠電泳（DDGE）、酶切擴增多態(tài)性序列（CAPS）、等位基因特異性PCR（AS-PCR）等[23]。SB-ASA方法是姜正文等[11]在基于等位基因?qū)Ｒ恍訮CR原理上發(fā)展起來的一種新的SNP分型方法，其原理是一個PCR反應(yīng)體系包含兩個3′末端分別與SNP兩個等位基因特異結(jié)合的引物，它們延伸方向相反，產(chǎn)生長度不同的等位基因?qū)Ｒ恍詳U增產(chǎn)物，同時在兩個等位基因特異性引物的3′端第3位堿基引入不配對能夠增加特異性。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分析確定樣本的基因型。這種方法后來應(yīng)用在近交系小鼠和近交系大鼠的遺傳檢測上[12-15]，效果很好，可有效地鑒別近交系品系。本文也進一步證實SB-ASA方法是一項開展SNPs分型的有效的方法。該方法操作簡便、快速，可同時測定三種SNPs等位基因類型，易于推廣。值得注意的是，用SB-ASA方法進行PCR反應(yīng)時，必須保證擴增全長片段的引物（內(nèi)參引物）的變性溫度Tm值和SNP位點特異性引物Tm值相差在3℃以內(nèi)。在條件優(yōu)化時，可通過改變引物的濃度比來達到最佳反應(yīng)條件[24]。本文選擇內(nèi)參引物和特異性引物分別為0.4、0.6 μmol/L，是為最佳引物濃度。

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（收稿日期：2018-03-26 本文編輯：李岳澤）