董海龍，王 琳，張作剛，暢引東，王建明

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心運(yùn)城分中心，山西運(yùn)城044600）

根結(jié)線蟲病是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響蔬菜設(shè)施栽培產(chǎn)量的重要根部病害之一，具有分布廣泛性、多寄主性、強(qiáng)侵染性和發(fā)生危害隱蔽等特點(diǎn)[1]。隨著設(shè)施蔬菜栽培的迅猛發(fā)展，根結(jié)線蟲的發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重地區(qū)可減產(chǎn)30%～40%，甚至絕收[2]。目前，農(nóng)業(yè)上防治其的最主要手段仍是噴灑農(nóng)藥和土壤消毒，從而造成農(nóng)藥大量殘留、環(huán)境污染。因此，提高蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，尋求安全、高效、環(huán)境友好型根結(jié)線蟲防治措施，已成為蔬菜產(chǎn)業(yè)迫在眉睫的重要需求。

真菌生防制劑作為環(huán)境友好型生物防治技術(shù)手段愈來愈受到人們的關(guān)注[3]，其產(chǎn)品多利用真菌孢子加工而成，國內(nèi)外真菌殺蟲劑的產(chǎn)業(yè)化多采用液-固雙相發(fā)酵方法[4]。采用該方法前期將液體深層發(fā)酵培養(yǎng)出芽生孢子接種到后期的固體基質(zhì)中產(chǎn)生分生孢子，適用于很多生防菌劑的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[5]。綠色木霉菌（Trichoderma viride）[6]、淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）[7]、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）[8]、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）[9]均是通過優(yōu)化液-固雙相發(fā)酵方法獲得較好的產(chǎn)孢量。

疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）是重要的線蟲生防真菌，該菌代謝產(chǎn)物主要防治根結(jié)線蟲屬、異皮線蟲屬、球藻屬、小墊刃屬等19個(gè)屬的線蟲[10]。其分生孢子作為生防制劑用于農(nóng)業(yè)病蟲害防治，國內(nèi)外研究還較少。前期研究表明，根結(jié)線蟲生物防治課題組保藏的1株疣孢漆斑菌X-16菌株對(duì)根結(jié)線蟲有較強(qiáng)的寄生作用，具有開發(fā)成生防菌劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的潛力。

本研究旨在探究疣孢漆斑菌X-16的生物學(xué)特性，開發(fā)該菌株的活菌制劑，以期對(duì)今后的工廠化生產(chǎn)該菌株的生物防治劑提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）菌株X-16，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，pH值自然。基礎(chǔ)培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀1 g，硫酸亞鐵0.01 g，七水硫酸鎂0.5 g，蒸餾水1 L，pH值自然。固體平板培養(yǎng)基是在PDA培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂18 g/L。

1.1.3 主要藥品試劑 葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、七水硫酸鎂、瓊脂，均購自奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同碳氮比（摩爾比）對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響 以葡萄糖和硝酸鈉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源和氮源，設(shè)置 C/N 為 5∶1，10∶1，20∶1，30∶1，60∶1，80∶1，100∶1和 120∶1。平板接菌培養(yǎng) 10 d后，利用血球計(jì)數(shù)板測定X-16菌株產(chǎn)孢量。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.2 不同碳濃度對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響 以葡萄糖和硝酸鈉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源和氮源，設(shè)置0.5，1.0，2.0，4.0 mol/L共 4 個(gè)碳質(zhì)量濃度，測定方法同1.2.1。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.3 不同碳源、氮源種類對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響 以硝酸鈉為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源，設(shè)置葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉為5個(gè)碳源；以葡萄糖為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源，設(shè)置硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏和尿素4個(gè)氮源。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，同時(shí)以無碳、氮源為空白對(duì)照。

1.2.4 不同溫度對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響 以PDA培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，設(shè)置 15，20，25，28，30，32，35，37℃共8個(gè)溫度。每處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.5 不同pH對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響 以PDA培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，設(shè)置pH值3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0 等處理。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.6 不同光照條件對(duì)X-16菌株產(chǎn)孢量的影響以PDA為供試培養(yǎng)基，在25℃下設(shè)置0，12，24 h光照。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel XP進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)之間用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳氮比對(duì)產(chǎn)孢量的影響

從圖1可以看出，疣孢漆斑菌在碳氮比是60∶1時(shí)產(chǎn)孢量最高，且與其余碳氮比間有顯著或極顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；碳氮比 20∶1 產(chǎn)孢量次之；而碳氮比是5∶1時(shí)，固體平板不產(chǎn)孢。

2.2 不同碳源濃度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

疣孢漆斑菌在碳濃度為1.0 mol/L時(shí)，產(chǎn)孢量最大，且與其他3個(gè)濃度間有顯著或極顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；濃度為 4.0，2.0 mol/L 時(shí)，產(chǎn)孢量較?。▓D 2）。

2.3 不同碳源、氮源種類對(duì)產(chǎn)孢量的影響

疣孢漆斑菌在可溶性淀粉為碳源的固體平板中產(chǎn)孢量最大，其次有機(jī)碳源是蔗糖，麥芽糖、葡萄糖、乳糖相對(duì)較少（圖3）。

疣孢漆斑菌在含有無機(jī)氮源硝酸鈉的固體平板中產(chǎn)孢量最大；其次依次是蛋白胨、酵母膏、尿素；無氮源對(duì)照處理產(chǎn)孢量最小（圖4）。

2.4 不同溫度對(duì)產(chǎn)孢量的影響

疣孢漆斑菌在15～37℃范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，但28～35℃產(chǎn)孢量顯著高于低溫25℃和高溫37℃，其中，30℃產(chǎn)孢量最大，其次為32℃；方差分析結(jié)果表明，25，28，35，37 ℃之間產(chǎn)孢量無顯著差異（圖 5）。

2.5 不同pH條件對(duì)孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢量的影響

疣孢漆斑菌在pH值3.5～9.0范圍內(nèi)均可產(chǎn)孢，但pH值為6～8時(shí)產(chǎn)孢量顯著高于其他pH值（P＜0.05），pH值為6.5時(shí)產(chǎn)孢量最高。菌株X-16對(duì)產(chǎn)孢環(huán)境的酸堿適應(yīng)性較強(qiáng)，變酸環(huán)境有利于產(chǎn)孢。

2.6 不同光照時(shí)間對(duì)產(chǎn)孢量的影響

疣孢漆斑菌在24 h全光照下產(chǎn)孢量最大，其次是全黑暗條件。方差分析結(jié)果表明，24 h光照和全黑暗產(chǎn)孢量間差異顯著（P＜0.05）。

3 結(jié)論與討論

疣孢漆斑菌分生孢子可寄生根結(jié)線蟲卵、二齡幼蟲和雌蟲[11]，該菌寄生線蟲過程中培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和環(huán)境因子如溫度、光照等對(duì)其產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)及致病力有顯著影響。有研究表明，提高疣孢漆斑菌產(chǎn)孢力的營養(yǎng)和環(huán)境條件，有助于提高該菌生防效果。本研究結(jié)果表明，疣孢漆斑菌X-16菌株產(chǎn)孢量最大的營養(yǎng)條件為：碳氮比60∶1在平板培養(yǎng)中生長最好；最適碳源是可溶性淀粉，碳濃度為1～2 mol/L時(shí)最有利于平板產(chǎn)孢；最適氮源是無機(jī)氮源硝酸鈉，有利于增加產(chǎn)孢量；環(huán)境條件為適宜菌株X-16產(chǎn)孢的溫度是30～32℃；適宜產(chǎn)孢的pH值是6.5；24 h光照有利于產(chǎn)孢。

肖順[12]研究報(bào)道，淡紫擬青霉菌株P(guān)L89產(chǎn)孢最適碳源是可溶性淀粉，最適氮源是酵母粉，本研究中X-16對(duì)碳源的利用與淡紫擬青霉相似，但最適氮源是硝酸鈉，與PL89有所不同；宋漳等[13]研究報(bào)道，綠僵菌最適產(chǎn)孢溫度是28℃，菌株X-16在30～32℃適宜產(chǎn)孢，較綠僵菌溫度生長范圍寬；朱茂山等[14]研究報(bào)道，木霉菌T41適宜產(chǎn)孢的pH值為2～11，其中，pH值為5的偏酸性條件下，T41菌株產(chǎn)孢量最大，全光照有利于產(chǎn)孢。菌株X-16適宜產(chǎn)孢pH值為6.5，光照條件是24 h全光照。不同營養(yǎng)和環(huán)境對(duì)球孢白僵菌HFW-05影響中發(fā)現(xiàn)，最適產(chǎn)孢的碳源為蔗糖、氮源為豆粕粉、無機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)孢量有抑制作用，而25℃外加紫外線照射1 h有利于產(chǎn)孢[15-16]。

疣孢漆斑菌是生物防治寄生線蟲的重要真菌，該菌代謝產(chǎn)物在歐洲已被登記用于果樹、蔬菜、作物寄生線蟲的防治，商品名稱是DiTera_DF DiTera_WP[10]。關(guān)于疣孢漆斑菌活體制劑的發(fā)酵條件國內(nèi)外尚無詳細(xì)報(bào)道。本研究結(jié)果可為疣孢漆斑菌的固-液雙相發(fā)酵提供參考。但本研究未評(píng)價(jià)中微量元素、維生素、金屬離子、土壤化學(xué)農(nóng)藥和鹽堿度對(duì)疣孢漆斑菌平板培養(yǎng)產(chǎn)孢影響，仍需進(jìn)一步研究。