張 源，蘭 偉，王明躍，張新紅，孫曉璐，劉文福，王士華

1.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，阜陽，236037；2.阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生化工程系，阜陽，236031；3.阜陽市鴻福農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，阜陽，236127；4.阜陽市潁泉區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測站，阜陽，236000

針對草莓酒的初步研究發(fā)現(xiàn)，利用單一酵母菌種發(fā)酵釀制的草莓酒酒質(zhì)純凈但口感較為淡薄，而自然發(fā)酵釀制的草莓酒雖然口感偏酸，但香味更豐富，口感也更醇厚［1-2］。表明草莓酒自然發(fā)酵過程中復(fù)雜的自然菌群對草莓酒的釀制具有積極作用。因此，研究草莓酒發(fā)酵過程中的自然菌群，闡明其群落結(jié)構(gòu)及組成，是后續(xù)深入研究草莓酒酒體特征形成機(jī)理的基礎(chǔ)，對彌補(bǔ)單一菌種發(fā)酵的產(chǎn)品缺陷，提升草莓酒品質(zhì)具有重要意義。

此前，有關(guān)微生物群落及其多樣性的研究主要基于傳統(tǒng)的微生物分離及純培養(yǎng)技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)［3］、變性梯度凝膠電泳技術(shù)（DGGE）［4］、末端限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（TRFLP）［5］等。但上述研究方法往往難以得到確切的微生物種類及其絕對含量［6］。高通量測序技術(shù)近年來發(fā)展迅速，該技術(shù)可快速、準(zhǔn)確、全面地解析樣本中的微生物群落，在環(huán)境微生物、食品微生物等研究中應(yīng)用廣泛［7-9］，但基于發(fā)酵過程的研究較少，特別是果酒自然發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落研究鮮有報道。研究表明，除酵母菌以外，細(xì)菌同樣會對發(fā)酵過程產(chǎn)生重要影響。如：葡糖桿菌屬（Gluconobacter）細(xì)菌在葡萄酒釀造過程中產(chǎn)生乙酸，對葡萄酒感官品質(zhì)產(chǎn)生不利影響［10］，而乳桿菌屬（Lactorbacillus）細(xì)菌的蘋果酸代謝則會導(dǎo)致葡萄酒產(chǎn)生異味［11-12］。因此，本研究利用高通量測序技術(shù)，對草莓酒發(fā)酵初、中、末期的細(xì)菌群落及其變化規(guī)律進(jìn)行研究，以期從宏觀上了解草莓酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落，分析其對草莓酒品質(zhì)的影響，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

草莓品種為“甜查理”，于2017年4月24日采收于阜陽市潁泉區(qū)聞集鎮(zhèn)文福草莓種植專業(yè)合作社。白砂糖（市售）；破碎機(jī)（合肥大漢釀酒設(shè)備有限公司）滅菌10 L發(fā)酵罐（煙臺帝伯仕自釀機(jī)有限公司）；控溫培養(yǎng)箱（LRH-70，上海-恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方 法

新鮮草莓經(jīng)破碎機(jī)破碎打漿，皮渣分離后，裝入無菌發(fā)酵罐。加入鮮重20%的白砂糖，25℃條件下自然發(fā)酵。在超凈工作臺內(nèi)分別采集發(fā)酵初期（第2天）、發(fā)酵中期（第8天）和發(fā)酵末期（第16天）的發(fā)酵樣品。樣品設(shè)兩個平行（初期A011，A012；中期 A021，022；末期 A031，A032），所取樣品 -20℃凍藏保存，后送往上海派森諾生物科技股份有限公司武漢分公司進(jìn)行測序，測序平臺為 Illumina Miseq。

根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，衡量樣本物種多樣性及組間樣本差異。根據(jù)每個樣本在各分類水平的具體組成，分析不同發(fā)酵時期樣本的群落結(jié)構(gòu)及群落組成的動態(tài)變化及差異。并在屬的分類水平上分析可能對草莓酒品質(zhì)產(chǎn)生重要影響的關(guān)鍵細(xì)菌類群。

測定發(fā)酵過程中（第 1，3，6，10，16天）的總糖、還原糖和總酸，測定方法參照GB／T15038-2006，酒精度測定參照GB5009225-2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)樣本的選擇與草莓酒自然發(fā)酵進(jìn)程

由于果酒發(fā)酵過程中的微生物主要來源于果實(shí)附著的環(huán)境微生物，因此，不同地區(qū)、不同氣候條件、不同季節(jié)，果實(shí)表面附著的微生物種群均存在一定差異［13-14］。但在草莓酒的生產(chǎn)中，由于企業(yè)主要選擇每年4～5月份草莓集中上市，價格低廉時組織生產(chǎn)，且為了使發(fā)酵后的草莓酒便于儲存，往往添加較高比例的蔗糖（通常為15%～20%），以獲取較高的酒精含量。因此，本研究選擇了4月底的草莓樣本，添加20%蔗糖的實(shí)驗(yàn)條件，以反映本地區(qū)該時間段草莓酒發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落情況。

結(jié)果顯示：在25℃條件下，第1～3天啟動發(fā)酵。第3～10天快速發(fā)酵，酒精度由2.0°快速升至12.1°。第10天后，酒精度緩慢升至 13.2°，發(fā)酵基本結(jié)束。發(fā)酵過程中，總糖呈快速下降趨勢，還原糖呈先升高后降低趨勢，總酸與pH值變化不明顯（見表1）。

表1 草莓酒自然發(fā)酵不同階段的理化指標(biāo)

2.2 宏基因組16S rDNA測序結(jié)果

2.2.1 OTU聚類及樣本復(fù)雜性分析

通過高通量測序，在發(fā)酵初、中、末期共得到的有效序列數(shù)、聚類得到OTU數(shù)見表2，稀疏曲線見圖1。

表2 有效序列數(shù)及OTU聚類

從表2和圖1可知，隨著測序數(shù)量的增加，稀疏曲線逐漸趨于平緩，表明測序結(jié)果已足夠反映當(dāng)前樣本所包含的多樣性，繼續(xù)增加測序深度也無法檢測到更多新的OTU。從測序深度指數(shù)可以看出，本實(shí)驗(yàn)的測序數(shù)據(jù)量已足夠大，基本可以反映草莓酒發(fā)酵過程中的絕大多數(shù)細(xì)菌信息。

為了比較不同樣本的多樣性，首先對OTU豐度矩陣中的全體樣本在90%的最低測序深度水平統(tǒng)一進(jìn)行隨機(jī)重抽樣，從而校正測序深度引起的多樣性差異。隨后，使用QIIME軟件分別對每個樣本計算4種多樣性指數(shù)。結(jié)果如表3所示。

圖1 稀疏曲線

表3 草莓酒自然發(fā)酵不同階段的細(xì)菌A lpha多樣性

物種豐富度指數(shù)Chao1與ACE值在發(fā)酵初、中、末期呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，顯示發(fā)酵中期的物種最豐富。物種多樣性指數(shù)Shannon和Simpson值在發(fā)酵末期最低，菌群結(jié)構(gòu)趨于簡單。這表明，草莓酒自然發(fā)酵過程中的絕大多數(shù)細(xì)菌比較適宜在發(fā)酵中期較低的酒精度和中等水平含糖量條件下生存，高的初始糖分與高酒精度環(huán)境均會抑制其生長繁殖。

2.2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

（1）門、綱、目、科分類水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

OTU物種注釋結(jié)果顯示，草莓酒自然發(fā)酵過程中的細(xì)菌分別屬于5個菌門，11個綱，18個目，47個科、86個屬。

在門的分類水平，變形菌門（Proteobacteria）細(xì)菌在草莓酒自然發(fā)酵的初、中、末期始終是絕對優(yōu)勢菌群，其豐度占到整個菌群的98.9%～99.6%。厚壁菌門（Firmicutes）雖然是第二大菌群，但其平均占比僅有0.3%～0.75%（見圖2A）。在科的分類水平，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）細(xì)菌在發(fā)酵的初、中、末期始終是絕對優(yōu)勢菌群，其豐度占到真?zhèn)€菌群的93.3%～97.6%，顯示出草莓酒自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高度不均一性。

從圖2可以看出，在門、綱、目、科的分類水平，發(fā)酵的初、中、末期除α-變形菌綱（Aiphaproteobacteria）、立克次體目（Rickettsiales）外，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并無明顯變化（圖2 B、C、D），顯示出草莓酒自然發(fā)酵過程中細(xì)菌群落具有相對穩(wěn)定性。進(jìn)一步分析顯示，mitochondria很可能是草莓果肉細(xì)胞中的線粒體基因組干擾所致（圖2D）。

圖2 發(fā)酵過程中草莓酒中菌群在門、綱、目與科水平的注釋結(jié)果

（2）屬分類水平的群落結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化

如表4所示，在屬的分類水平上，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)同樣表現(xiàn)出高度的不均一性。本研究共檢測到86個屬，但其中豐度最高的前13個屬相對豐度已占整個菌群的97.7%～99%，而其余73個屬（Others）的總豐度不及2.4%（表4）。

在屬的分類水平上，腸桿菌科的歐文氏菌屬（Erwinia）、泛菌屬（Pantoea）、未知屬（unidentified）和檸檬酸菌屬（Citrobacter）細(xì)菌是優(yōu)勢菌群，占整個菌群的91.8% ～97.5%（表4）。但在發(fā)酵的初、中、末期，屬水平的群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。其中，歐文氏菌屬細(xì)菌在發(fā)酵過程中呈逐漸上升趨勢；而泛菌屬與未知屬則呈逐漸下降趨勢。檸檬酸菌屬細(xì)菌相對占比較低，在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。但至發(fā)酵末期，它們?nèi)员３至讼鄬^高的菌群占比，顯示出其對發(fā)酵過程中高糖、高酸、高酒精度環(huán)境具有一定適應(yīng)性。

從表4可以看出，其他菌群，如葡糖桿菌屬（Gluconobacter）、雷爾氏菌屬（Ralstonia）、乳酸球菌屬（Lactococcus）、沙雷氏菌屬（Serratia）、伯克氏菌屬（Burkholderia）等細(xì)菌在菌群的占比均較低，且在整個發(fā)酵過程中的豐度無明顯變化，表明發(fā)酵環(huán)境抑制其生長繁殖。

表4 屬分類水平上的優(yōu)勢菌群及其結(jié)構(gòu)

2.2.3 分類學(xué)組成的差異分析及其與草莓酒品質(zhì)的關(guān)系

為進(jìn)一步分析發(fā)酵初、中、末期屬水平的菌群差異，使用 Mothur軟件，調(diào)用 Metastats［15］的統(tǒng)計學(xué)算法，對屬水平的各個分類單元在發(fā)酵初、中、末期之間的序列量（即絕對豐度）差異進(jìn)行兩兩比較檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，分別有10個屬、7個屬、6個屬存在顯著性差異（P＜0.05）（見表5）。表明在屬水平，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)同樣具有相對穩(wěn)定性，存在顯著性豐度差異的菌群較少。

表5 不同發(fā)酵階段樣本之間的M etastats兩兩比較檢驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計表

如表5所示，在發(fā)酵初、中、末期存在顯著性差異，且菌群豐度較高的有歐文氏菌屬、泛菌屬、檸檬酸菌屬、乳酸球菌屬、葡糖桿菌屬、雷爾氏菌屬等。由于果酒發(fā)酵過程中的微生物主要來源于果實(shí)附著的環(huán)境微生物，草莓酒發(fā)酵初期的菌群結(jié)構(gòu)基本代表了草莓果實(shí)自然附著的細(xì)菌類群，其對酒體的影響主要表現(xiàn)在后續(xù)生長繁殖過程中的生理代謝底物、產(chǎn)物及代謝底物、產(chǎn)物的數(shù)量。因此，上述優(yōu)勢菌群及其動態(tài)變化與草莓酒的風(fēng)味密切相關(guān)。

如表5所示，歐文氏菌屬豐度在發(fā)酵初期與中期的豐度無顯著差異，而發(fā)酵中期與末期存在顯著性差異，表明歐文氏菌屬細(xì)菌在發(fā)酵中后期存在顯著的菌群增殖。檸檬酸菌屬細(xì)菌豐度在發(fā)酵初期與中期存在顯著性差異，而初期與末期無顯著性差異，表明其在發(fā)酵中期存在顯著的菌群增殖，但至發(fā)酵末期，其豐度又回落到初期的水平。乳酸球菌屬細(xì)菌豐度在發(fā)酵初期與中期，初期與末期存在顯著性差異，但中期與末期無顯著性差異，表明其在發(fā)酵中期存在顯著的菌群增殖，隨后保持相對穩(wěn)定的菌群狀態(tài)。由于它們在發(fā)酵過程中均存在顯著的菌群增殖過程，其生理代謝必然會對酒體風(fēng)味產(chǎn)生影響。研究顯示，歐文氏菌屬細(xì)菌可以產(chǎn)生果膠裂解酶［16］，可分解果膠，因此，可能與草莓酒的顏色浸提及果酒澄清有關(guān)系。某些檸檬酸菌屬細(xì)菌可產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶［17］，而β-葡萄糖苷酶可用于果酒增香、脫苦等［18］，與自然發(fā)酵草莓酒更豐富的香氣［1］可能存在一定關(guān)系。乳酸球菌屬細(xì)菌可代謝產(chǎn)生乳酸［11，12］，與自然發(fā)酵草莓酒中較高的乳酸含量［1］關(guān)系密切。

泛菌屬豐度在發(fā)酵初期、中期與末期均存在顯著性差異，表明泛菌屬細(xì)菌隨著發(fā)酵的進(jìn)行經(jīng)歷了持續(xù)的菌群衰亡，但至發(fā)酵末期仍然保持了較高的菌群豐度。表明其盡管不適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，但仍有一定耐受力。有研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬的Pantoea ananatis可產(chǎn)生香味物質(zhì)［19］。因此，該類細(xì)菌與草莓酒風(fēng)味形成可能存在關(guān)系。但值得注意的是，由于高通量測序技術(shù)以微生物DNA作為檢測基礎(chǔ)，無法區(qū)分死細(xì)菌與活細(xì)菌，因此，發(fā)酵末期的酒體中是否真的存在大量泛菌屬細(xì)菌仍需要傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法予以驗(yàn)證。

在草莓酒發(fā)酵過程中，葡糖桿菌屬豐度無顯著差異，檸檬酸菌屬細(xì)菌雖然在發(fā)酵中期存在顯著的菌群增殖，但它與葡糖桿菌屬細(xì)菌在發(fā)酵末期的菌群豐度均不高。但葡糖桿菌屬細(xì)菌能夠代謝乙醇產(chǎn)乙酸，而檸檬酸菌屬細(xì)菌可以利用檸檬酸鹽作為唯一碳源代謝檸檬酸，且檸檬酸是草莓果實(shí)中最主要的有機(jī)酸［1，20］，這表明，在發(fā)酵末期高乙醇、低糖的條件下，盡管這類細(xì)菌的豐度較低，但它們在酒體的后期陳釀過程中可能發(fā)揮著更為重要的作用，并與陳釀草莓酒中較高的乙酸含量［1］和較低的檸檬酸含量［1］存在密切關(guān)聯(lián)。

受高通量測序技術(shù)的局限性，本研究中腸桿菌科未知屬（unidentified）未能得到有效鑒定，盡管其在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)菌群衰亡趨勢，但由于相對豐度較高，該類細(xì)菌與草莓酒風(fēng)味形成可能存在一定關(guān)系。對此，仍需依賴傳統(tǒng)的微生物分離及純培養(yǎng)技術(shù)對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)，初步闡明了草莓酒自然發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，并分析了優(yōu)勢菌群與草莓酒酒體特征及風(fēng)味之間的關(guān)系。結(jié)果表明：（1）變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科細(xì)菌是草莓酒自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群。在屬水平，歐文氏菌屬、泛菌屬、腸桿菌科未知屬、檸檬酸菌屬、葡糖桿菌屬、乳酸球菌屬等是草莓酒自然發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢屬。（2）發(fā)酵初、中、末期存在顯著豐度差異的菌群較少，細(xì)菌群落在發(fā)酵過程中具有相對穩(wěn)定性。（3）發(fā)酵過程中的菌群動態(tài)分析及屬水平的Metastats分析顯示，歐文氏菌屬、檸檬酸菌屬、葡糖桿菌屬、乳酸球菌屬細(xì)菌與自然發(fā)酵草莓酒的酒體特征及風(fēng)味之間存在較為密切的關(guān)聯(lián)。