秦 謙 陳 鄉(xiāng) 盧宇藍(lán) 吳冰冰 王慧君 董欣然 楊 琳 周文浩,2,

遺傳性果糖不耐受(HFI，MIM: 229600)是由于ALDOB基因變異導(dǎo)致的遺傳代謝性疾病，呈常染色體隱性遺傳。其主要表現(xiàn)為攝入果糖、蔗糖或山梨醇后出現(xiàn)低血糖、乳酸酸中毒、低血磷、高尿酸血癥、高鎂血癥、高丙氨酸血癥等代謝指標(biāo)異常。臨床發(fā)現(xiàn)主要為惡心、嘔吐、腹痛、腹脹[1]。長期反復(fù)攝入含這些成分的食物可導(dǎo)致生長發(fā)育遲緩、智力障礙和肝腎功能異常，短期大量攝入者有較高的死亡風(fēng)險。該病的發(fā)病率為1∶20 000至1∶30 000，在不同人種之間有一定差異，目前尚無中國人群發(fā)病率數(shù)據(jù)[2]。本文報告1例ALDOB基因復(fù)合雜合變異致HFI及30年隨訪結(jié)果，結(jié)合人類遺傳變異數(shù)據(jù)庫(HGMD)進(jìn)行HFI疾病表型和基因型關(guān)聯(lián)分析。

1 方法

1.1 病例報告 女，4歲，因“不明原因低熱，嘔吐后癥狀緩解”就診。

既往史：患兒系G2P1，胎齡39周，出生體重3.5 kg。父母非近親婚配，家族中無明確診斷的遺傳病史。患兒生后20 d開始添加奶粉喂養(yǎng)，吃奶后立即出現(xiàn)嘔吐，嘔吐物為胃內(nèi)容物，無黏液、膿血，嘔吐后癥狀消失，發(fā)病過程中不伴有發(fā)熱、反應(yīng)差，大小便正常。多次因不明原因低熱、嘔吐后緩解就診。后改為米粥喂養(yǎng)，嘔吐癥狀緩解。嬰幼兒期體型瘦弱，易哭鬧，較難安撫。智力發(fā)育正常，運動能力發(fā)育遲緩。1歲開始說話，17月齡可以扶墻行走，23月齡仍獨走不穩(wěn)。

兒童期食西瓜、蛋糕等食物后約半小時出現(xiàn)嘔吐癥狀，伴低熱，嘔吐后癥狀可緩解。家屬開始自行停喂含糖類食物。7歲時曾以“吃甜食后半小時左右開始低熱、饑餓感，嘔吐后可緩解，面色不佳，體質(zhì)較差，易感冒”主訴就診上海某醫(yī)院。當(dāng)時體格檢查：身高137 cm，體重17 kg，面色黃，體型瘦弱，反應(yīng)正常，毛發(fā)正常，視力、心率、呼吸、四肢活動和肌張力未見異常。未行實驗室檢查。診斷“生長發(fā)育不良，遺傳代謝性疾病待查”，囑避免進(jìn)甜食。

家屬開始系統(tǒng)篩選和記錄能引起患兒嘔吐癥狀的水果、蔬菜和食物，家中做菜不添加食糖作料等。

目前隨訪至30歲，身高174.6 cm，體重57.6 kg，BMI 18.9 kg·m-2。智力發(fā)育正常，從事生物信息分析工作。心、肺、甲狀腺、眼、耳、鼻、喉查體未見異常。腹部超聲檢查示肝區(qū)回聲較密尚均，包膜光滑，肝內(nèi)血管走形清晰，肝內(nèi)膽管未見明顯擴(kuò)張；脾臟大小正常，回聲分布尚均勻；膽道系統(tǒng)未見明顯異常，胰腺形態(tài)正常，雙腎回聲分布尚可，形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常。血、尿常規(guī)、肝、腎功能未見異常。未行果糖負(fù)荷試驗和肝組織醛縮酶B活性檢測。

患者期望行基因檢測明確遺傳代謝性疾病待查診斷，在取得其父母知情同意下行全基因組序列檢測。

1.2 基因檢測 采集患者及其父母外周靜脈血，行全基因組高通量測序(WGS)檢查。血樣抽提基因組DNA后，用超聲儀將DNA隨機(jī)打斷成300～400 bp片段，磁珠純化后產(chǎn)物經(jīng)末端修復(fù)后進(jìn)行接頭連接、PCR擴(kuò)增，形成測序文庫，使用illumina測序儀測序(Pair End，片段長度150bp)。采用Qubit檢測文庫濃度，Agilent 2100 Bio analyzer檢測文庫片段長度和濃度。原始測序數(shù)據(jù)(fastq格式)首先采用FastQC[3]進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量評估，給出基本統(tǒng)計信息、堿基質(zhì)量分布、ATCG比例分布、GC含量分布、測序讀長分布、重復(fù)水平評估和接頭序列比例等數(shù)值；采用BWA[4]和GATK[5]算法推薦流程將原始數(shù)據(jù)比對到參考基因組(hg19)得到bam格式的文件，用GATK中部分模塊對比對結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量統(tǒng)計，包括比對率、PCR冗余度、測序深度等；采用GATK算法推薦流程從bam格式文件中進(jìn)行變異獲取，包含SNV(單核苷酸位點變異)、indel(小片段插入和缺失)、CNV(拷貝數(shù)變異)、SV(結(jié)構(gòu)變異)和STR(串聯(lián)重復(fù)序列)，同時對每種變異情況進(jìn)行統(tǒng)計。在獲取變異后，由復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)內(nèi)部生物信息小組開發(fā)的WGS自動分析系統(tǒng)進(jìn)行后續(xù)分析。該系統(tǒng)首先對變異位點進(jìn)行篩選、注釋和分析[6]，包含了數(shù)據(jù)質(zhì)控、位點位置篩選、公共人群頻率篩查、本地人群頻率篩查、疾病數(shù)據(jù)庫(比如ClinVar[7]、OMIM[8])對變異進(jìn)行注釋、ANNOVAR[9]功能注釋、疾病遺傳模式的評估、分析公共數(shù)據(jù)庫或者內(nèi)部數(shù)據(jù)庫既往報道情況等步驟，得到優(yōu)選致病位點；同時用我院開發(fā)的臨床表型自動匹配系統(tǒng)[10]自動采集患者表型并結(jié)構(gòu)化為HPO[11]條目，再和優(yōu)選位點進(jìn)行匹配，得到符合臨床表型的疑似致病位點，最終交由我院遺傳咨詢團(tuán)隊進(jìn)行人工審核。父母外周血提取DNA，進(jìn)行一代測序驗證。

2 結(jié)果

2.1 基因檢測結(jié)果 患者血液樣本抽提DNA質(zhì)量合格，CNV共計52個重復(fù)、114個缺失，SV共計1 526個易位、2 825個插入和431個倒位，這兩類變異經(jīng)過功能注釋后未得到疑似致病變異，已知的三堿基串聯(lián)重復(fù)序列相關(guān)疾病的堿基重復(fù)倍數(shù)均在正常范圍之內(nèi)。繼續(xù)進(jìn)行測序，得到467 894 022成對的測序片段，將序列比對到hg19共獲取變異位點5 091 071個。通過我院WGS自動分析系統(tǒng)優(yōu)選出31個重要位點(圖1)，其中20個(65%)為錯義變異，1個為移碼突變。根據(jù)患者臨床表型自動給出HPO條目HP:0005973(果糖不耐受，F(xiàn)I)，通過臨床表型自動匹配可以得到其中2個疑似致病變異，提示患者攜帶ALDOB基因兩個變異：①NM_000035, exon4:c.360_363delCAAA (p.N120Kfs*32)，②exon9:c.1013C>T(p.A338V)。Sanger驗證顯示，A338V來自父親，N120Kfs*32來自母親，為復(fù)合雜合變異(圖2)。2個變異位點均為已報道的致病變異[12, 13]。

2.2 患者飲食譜的總結(jié)

2.2.1 不可食用 ①食物制作加工中添加糖、蜂蜜、木糖醇、阿斯巴甜、安賽蜜、玉米糖漿等；②藥物類中，糖漿類、含甘草等成分中成藥、含果糖、營養(yǎng)液等；③蔬菜類中，胡蘿卜、甘薯、南瓜、甜玉米；④幾乎所有水果。

2.2.2 少許食用 ①蔬菜類：洋蔥、蘿卜、苔薹、慈姑、蓮藕、荸薺、卷心菜、甘藍(lán)、西蘭花、花椰菜、番茄、彩椒、黃瓜、絲瓜、西葫蘆、冬瓜、茄子；②水果類：柚子、檸檬等酸性水果，牛油果；③作料：醋、蒸魚豉油；④藥物：含片類藥物。

圖1WGS分析流程圖

注 1)：比對到hg19上且方向正確的reads占99.8%，PCR過程生成的reads占22.8%，雙端都比對到hg19上的reads占97.6%，堿基覆蓋度占全基因組堿基總長的99.2%，堿基覆蓋度不低于20X的97.7%

圖2Sanger驗證結(jié)果原始圖像

2.2.3 可食用 ①奶類、肉類、海鮮類、蛋類、谷物、堅果；②蔬菜類：萵筍、蘆筍、竹筍、芋頭、土豆、茭白、菱角、蕨菜、萵苣、大部分葉菜類、豆芽、豆苗、金針菜、芥藍(lán)、辣椒、苦瓜、各種豆類、所有菌類；③葡萄糖、糊精、麥芽糖，大部分作料，膠囊類、片劑類藥物、外用藥物，無添加成分包的茶、咖啡、酒類(啤酒、干紅、白酒)等。

2.3 表型、基因型關(guān)聯(lián)分析 目前認(rèn)為ALDOB基因的表型基因型關(guān)系不明確。本文總結(jié)了HGMD數(shù)據(jù)庫收錄為致病變異、同時有詳細(xì)臨床信息的33例HFI患者資料(表2)。按照是否控制飲食來分，在8例未控制飲食的患者中，6例(75%)預(yù)后不良(包括2例死亡、2例肝功能衰竭、1例肝功能異常、1例生長發(fā)育遲緩)，在2例預(yù)后尚可的患者中，攜帶的變異類型均為錯義變異；在19例進(jìn)行飲食控制的患者中(包括文獻(xiàn)中18例及本文患者)，9例(47.4%)預(yù)后不良。在9例進(jìn)行飲食控制但仍出現(xiàn)預(yù)后不良的患者中，變異位點中55.6%(10/18)為移碼變異，5.6%(1/18)為剪接位點變異，38.9%(7/18)為錯義變異；在10例進(jìn)行飲食控制后未出現(xiàn)預(yù)后不良的患者中，變異位點中30%(6/20)為移碼變異，25%(5/20)為剪接位點變異，45%(9/20)為錯義變異。該結(jié)果提示：1)飲食控制者預(yù)后好于非飲食控制者；2)變異類型對患者預(yù)后有一定的預(yù)測作用，即攜帶移碼變異的患者在飲食控制后仍有可能預(yù)后不良；3)未控制飲食下無嚴(yán)重不良預(yù)后的患者均攜帶錯義變異，此類變異類型可能對蛋白質(zhì)功能影響較小。該結(jié)論有待進(jìn)一步的功能學(xué)研究證實。

表2 HGMD數(shù)據(jù)庫收錄為致病變異的同時有詳細(xì)臨床信息的33例遺傳性果糖不耐受患者的資料

注 NA：未描述；het：雜合突變；hom：純合突變

3 討論

果糖代謝異常相關(guān)的單基因遺傳病有果糖尿病(MIM: 229800)、 HFI(MIM: 229600)和果糖-1,6-雙磷酸酶缺乏癥(MIM: 229700)[1]。本文患者臨床發(fā)現(xiàn)基本符合HFI疾病表型。WGS測序提示患者攜帶ALDOB基因的2個突變，NM_000035, exon4:c.360_363delCAAA (p.N120Kfs*32)和 exon9:c.1013C>T(p.A338V)，均為HGMD數(shù)據(jù)庫[14]報道的已知致病變異。A338V來自患者父親，N120Kfs*32來自患者母親。A338V在1998年首次被Ali等[13, 15]報告，該位點見于歐洲人群，為罕見變異。N120Kfs*32首次于1990年被Dazzo等[12]報告，攜帶該變異的患者為39歲婦女，表現(xiàn)為進(jìn)食甜食后出現(xiàn)腹痛、消化不良、易疲勞，臨床發(fā)現(xiàn)與本文患者相似。本文患者未檢測到KHK和FBP1基因的致病或疑似致病變異。綜合臨床發(fā)現(xiàn)、測序結(jié)果以及家系內(nèi)驗證結(jié)果，可明確診斷為HFI。近年來，隨著遺傳檢測的費用下降，遺傳檢測已經(jīng)取代侵入性的肝活檢以評估醛縮酶B活性，成為HFI主要的診斷手段。

本文患者嬰幼兒期懷疑HFI，雖然未行果糖負(fù)荷試驗，家長有意識地系統(tǒng)篩選禁忌水果、蔬菜和食物，在逐步嚴(yán)格控制禁忌水果、蔬菜和食物的30年中，生長發(fā)育、智力發(fā)育和肝功能均得到了較好的保護(hù)，并為ALDOB基因突變的HFI果糖-1,6-二磷酸醛縮酶B功能缺陷導(dǎo)致果糖代謝疾病相關(guān)的代謝通路，提供了較為完備的可食用、可食用少許劑量和禁忌食譜。既往ALDOB基因的表型基因型關(guān)系并不明確，本文分析HGMD數(shù)據(jù)庫收錄為致病變異、同時有詳細(xì)臨床信息的33例患者加上本文1例，行表型基因型關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，未控制飲食患者預(yù)后不良比例 [6/8例(75%)] 高于飲食控制患者[9/19例(42%)]。但是，在進(jìn)行飲食控制的患者中，仍有50%預(yù)后不良，進(jìn)一步分析變異類型，這些患者中移碼變異占55.6%，高于控制飲食后未出現(xiàn)預(yù)后不良的患者(27.8%)。提示變異類型與患者預(yù)后有一定關(guān)聯(lián)，攜帶移碼變異的HFI患者在控制飲食的情況下仍可能預(yù)后不良，需要更為嚴(yán)格的飲食控制并密切隨訪。

果糖不耐受是不明原因慢性腹痛患兒的主要病因之一[16]，由于該疾病癥狀嚴(yán)重程度的異質(zhì)性，實際患病率可能高于目前實際診斷。表2中例4既往臨床癥狀較輕，因外科手術(shù)術(shù)中攝入50 g果糖、術(shù)后腸外營養(yǎng)含果糖，于手術(shù)后第6 d死亡[17]。提示對于不明原因嘔吐、慢性腹痛患者，要予以重視，應(yīng)考慮HFI可能。是否應(yīng)該在健康人群或新生兒期進(jìn)行相應(yīng)的篩查，也值得進(jìn)一步探討。

HFI是由于果糖-1,6-二磷酸醛縮酶B的功能缺陷導(dǎo)致。果糖-1,6-二磷酸醛縮酶(EC 4.1.2.13)是一種四聚體催化酶，催化底物為果糖-1,6-二磷酸和果糖-1-磷酸，在脊椎動物中有3種同功醛縮酶ALDOA、ALDOB和ALDOC。3種酶C末端的同工酶特異性區(qū)域決定了其不同功能。ALDOB主要在肝臟和腎臟中表達(dá)，ALDOA主要在肌肉和紅細(xì)胞中表達(dá)。果糖在肝臟中通過ALDOB催化參與糖異生，在肌肉脂肪組織中通過 ALDOA催化參與糖酵解。 ALDOB缺乏可導(dǎo)致果糖在肝、腸和腎臟中的不完全代謝，導(dǎo)致底物果糖-1-磷酸的積累，從而引起相應(yīng)臨床表型。ALDOB基因缺失的小鼠同樣表現(xiàn)出果糖不耐受表型[18]。

目前，ALDOB基因的熱點變異為A149P、A174D、N334K,、A337V、R303W和R59X。其中A149P、A174D和N334K是歐洲和北美人群的主要變異[19]。本文患者攜帶的變異均為非熱點變異。在復(fù)旦兒科人群中(12 807例panel ,9995例WES)，A338V和N120Kfs*32的人群頻率均為0.1%，且均為雜合攜帶者。復(fù)旦兒科人群數(shù)據(jù)庫中，暫無其他攜帶ALDOB基因復(fù)合雜合變異患者的報道。僅有1例已知致病變異攜帶者(p.D219N)有肝臟和消化道功能異常的癥狀。Esposito等[18]發(fā)現(xiàn)雜合攜帶者在食用果糖后有輕微的低血糖反應(yīng)，提示該基因存在半合劑量不全特征。