陳忠勝，羅義琳，李梁和，田斌，鄭璐，田甜，余蕾, ，廖欣，詹瑋,

（貴州醫(yī)科大學(xué) 1.研究生院 2.病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州省婦幼保健醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽550004；貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 4.影像科 5.普通外科，貴州 貴陽 550004）

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，隨著人口老齡化、遺傳、生活方式（如喝酒、吸煙、飲食等）以及環(huán)境的改變，結(jié)直腸癌的高發(fā)病率居高不下，目前，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的前三，其病死率也高達(dá)第4位[1]。據(jù)2015年一項(xiàng)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，盡管腫瘤的根治性切除的改進(jìn)，增加了患者的5年生存率，我國(guó)結(jié)直腸癌病死率高達(dá)50%以上[1-2]。而結(jié)直腸癌是一種具有高度特異性的惡性腫瘤，其在臨床病理特征、組織形態(tài)、免疫表型、治療效果以及生物學(xué)行為等方面存在較大差異，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是患者重要的死亡原因[3-4]。

組蛋白修飾在疾病的研究中備受關(guān)注，其中組蛋白甲基化修飾及乙酰化修飾在腫瘤方面的研究更為常見。組蛋白乙?；揎椏捎绊懠?xì)胞內(nèi)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而參與了相應(yīng)位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中起重要作用。因此，本實(shí)驗(yàn)著重觀察結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480及結(jié)腸癌組織中組蛋白乙?；揎椀南鄳?yīng)位點(diǎn)的變化情況，以期了解組蛋白乙?；揎椩诮Y(jié)腸癌中的修飾情況，為后續(xù)進(jìn)一步的有關(guān)結(jié)腸癌在組蛋白乙酰化修飾方面更深入的研究做好前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460及人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480均購(gòu)于上海歌凡生物科技有限公司。使用NCCN指南中關(guān)于結(jié)腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過腹部增強(qiáng)CT、腸鏡及病理活檢選取了10例明確診斷為無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌的可行手術(shù)治療的患者，取出患者手術(shù)切下的腸段，分別選取正常結(jié)腸組織及結(jié)腸腫瘤組織（均通過病理檢測(cè)證實(shí)）。

1.2 主要試劑

胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；DNaseⅠ、彩虹Marker購(gòu)自Solarbio；細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Alexa Fluor488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）、DyLight549標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E-Plate檢測(cè)板購(gòu)于埃森生物（杭州）有限公司，acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體均購(gòu)自Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清及含青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于5%、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 提取細(xì)胞核及核蛋白制備 將細(xì)胞及組織利用核漿分離技術(shù)提取目的核蛋白。按每1×106個(gè)細(xì)胞加入裂解液100 μL核蛋白酶抑制劑1 μL的比例冰上裂解30 min，1 200 r/min低溫離心10 min，提取細(xì)胞的核蛋白，-80 ℃保存。

1.3.3 組織標(biāo)本處理 將選取的正常結(jié)腸組織及結(jié)腸腫瘤組織，用EP管分裝，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.4 Western blot分析組蛋白乙?；癄顟B(tài) 將提取的細(xì)胞及組織的核蛋白，以100 g/L或120 g/L的SDS-PAGE分離，濕法電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h，加入不同濃度的一抗（組蛋白乙酰化修飾位點(diǎn) acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體1:1 000，H3抗體1:400），4 ℃過夜，TBS洗滌液洗膜后分別放入用TBS按1:1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室溫下?lián)u床作用1 h，TBS洗滌液洗膜后化學(xué)發(fā)光法顯色，X線片曝光，以H3為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot法檢測(cè)正常結(jié)腸上皮細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞組蛋白乙?；揎椝?/h3>

使用Western blot檢測(cè)NCM460與SW480細(xì)胞的acH3K9、acH3K14、acH3K18乙?；揎椝?。結(jié)果顯示，與NCM460比較，SW480細(xì)胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平明均顯下調(diào)（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 Western blot法檢測(cè)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本中乙酰化修飾水平

使用Western blot法檢測(cè)腸癌患者手術(shù)切除的腫瘤腸段組織和同一腸癌患者手術(shù)切除后非腫瘤腸段組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27乙?；竭M(jìn)行檢測(cè)，與正常結(jié)腸上皮組織相比，結(jié)腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05）（圖2）。

3 討 論

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確，因腫瘤的早期癥狀不明顯，大部分腫瘤患者確診時(shí)已處于中晚期，盡管以根治性切除為主的治療方法已經(jīng)很大程度上延長(zhǎng)了患者的生存期，但其晚期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是結(jié)直腸癌患者死亡的重要原因[5]。

近年來，表觀遺傳學(xué)的研究逐漸被認(rèn)為與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素之一[6]，表觀遺傳是指不通過改變DNA序列就能影響基因表達(dá)的、可以遺傳的遺傳修飾方式，而組蛋白修飾包括甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化等[7-8]，這些修飾的程度與狀態(tài)決定著基因是否表達(dá)[7]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；诩膊〉陌l(fā)生發(fā)展中起著重要的意義，而其中H3K9乙?；切揎椈蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機(jī)制。組蛋白乙?；揎椂嘣贖3賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點(diǎn)和H4精氨酸殘基上的5、8、12、16位點(diǎn)，而這些位點(diǎn)可激活基因也可沉默基因[10-11]。組蛋白乙?；揎検峭ㄟ^組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）聯(lián)合調(diào)控，取決于HAT和HDAC的動(dòng)態(tài)平衡[12]。組蛋白的尾部有多種化學(xué)修飾作用，這些修飾可以影響基因的表達(dá)（例如：H3和H4發(fā)生乙酰化后有利于激活基因轉(zhuǎn)錄，而H3K9發(fā)生甲基化后可以抑制基因轉(zhuǎn)錄）[13]。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶的主要功能是對(duì)核心組蛋白N端25～40個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的賴氨酸進(jìn)行乙?；揎棧琀AT將乙酰輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白N端賴氨酸的ε-氨基上，從而中和了其正電荷，增加了疏水性，削弱了DNA與組蛋白的相互作用，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[14]。

近年的研究[15]顯示，腫瘤的發(fā)生不僅與DNA甲基化有關(guān)，同樣的，組蛋白乙?；彩菂⑴c其中。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；毕菰诩毙园籽〉陌l(fā)病中起著重要的作用，也有相關(guān)報(bào)道[17]證實(shí)正常乳腺組織中乙?；慕M蛋白H3、H4的表達(dá)均較乳腺癌高。關(guān)于組蛋白乙?；谀c癌中的修飾表達(dá)，國(guó)外已有相關(guān)的報(bào)道[18]顯示：組蛋白的異常乙?；c結(jié)直腸癌的發(fā)病有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與NCM460相比，SW480細(xì)胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào)；與正常結(jié)腸上皮組織相比，結(jié)腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào)。有學(xué)者[19]研究證實(shí)：在結(jié)直腸癌與其他腫瘤中，組蛋白乙?；档?；然而，對(duì)特定部位的檢查表明，乙?；梢陨险{(diào)或下調(diào)。而Fraga等[20]使用Western blot分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系H4K16中出現(xiàn)乙?；档?，而在未分化結(jié)腸腺癌中觀察到H4K12和H3K18的低乙?；诜只己玫慕Y(jié)直腸腫瘤中，其乙酰化修飾程度增加[21]。與這些發(fā)現(xiàn)相反，H3K9的低乙?；癄顟B(tài)與腫瘤組織學(xué)類型呈正相關(guān)，在分化良好的腫瘤中觀察到H3K9Ac乙酰化水平降低[22]。在其他實(shí)體腫瘤中，即肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，H3K27乙?；脑黾釉谀[瘤部分比在相應(yīng)的基質(zhì)中更明顯[23]。在前期有關(guān)肝癌中組蛋白乙酰化修飾水平也出現(xiàn)了類似的變化[24]。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究將更深入的研究組蛋白乙?；揎椩诮Y(jié)腸癌中體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)其染色質(zhì)免疫共沉淀等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以期組蛋白乙?；揎椩诮Y(jié)腸癌中的機(jī)制。