吳秀琳 陳光春 李明霞 郭亮 吳學(xué)玲

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是由各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致炎癥失控，以急性呼吸困難，低氧血癥和非心源性肺水腫為特征的急性臨床綜合征，是膿毒血癥、爆發(fā)性流感、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome, SARS)、重癥肺炎等疾病的主要死亡原因[1-4]。重度細(xì)菌感染造成的膿毒血癥是ALI最常見死亡原因之一，而綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa, PA)則是引發(fā)膿毒癥的常見致病菌之一。雖然通過有效抗生素及機械通氣等手段，臨床治療已取得了很大進(jìn)展，但療效欠佳，其發(fā)病率及死亡率仍居高不下，病死率高達(dá)40%左右[5]。因此，進(jìn)一步深入研究ALI/ARDS發(fā)病機制及防治則具有重大的臨床意義。

近年來研究證實，炎癥反應(yīng)失控是ALI/ARDS本質(zhì)，但其發(fā)病機制十分復(fù)雜，尚不完全明確。激活的巨噬細(xì)胞(activated macrophages, AMs)通常是早期肺部炎癥反應(yīng)的導(dǎo)火索[6-7]，而激活的中性粒細(xì)胞(polymorphonuclearleukocyte, PMN)引起的炎癥失衡則被認(rèn)為是ALI/ARDS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8]，其在肺內(nèi)過度募集、激活是啟動絕大多數(shù)ARDS的早期和重要事件，是造成過激炎癥反應(yīng)的“元兇”[9]。而最新研究表明，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活化轉(zhuǎn)錄因子3(activating transcription factor 3, ATF3)可抑制PMN在肺內(nèi)的遷移[10]。很多研究均證實了ATF3對炎癥反應(yīng)有“剎車”作用，是TLR4/NF-κB信號通路的重要的負(fù)性調(diào)控基因[10-14]。我們前期預(yù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS腹腔注射后，ATF3 mRNA及蛋白表達(dá) 在2 h其mRNA水平出現(xiàn)明顯一過性升高。由此，基于文獻(xiàn)報道和前期實驗結(jié)果，我們推測ATF3可能通過負(fù)性調(diào)控炎癥損傷而參與調(diào)節(jié)ALI的發(fā)生發(fā)展。我們有理由相信上調(diào)ATF3的表達(dá)對急性肺損傷小鼠有保護(hù)作用，對于其在綠膿桿菌誘發(fā)的ALI肺部炎癥性損傷的保護(hù)作用仍需進(jìn)一步證實。

本文旨在進(jìn)一步明確ATF3在綠膿桿菌致急性肺損傷中的作用，繼續(xù)構(gòu)建綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺模，探討ATF3在綠膿桿菌致急性肺損傷中的表達(dá)規(guī)律及意義。

材料與方法

一、實驗材料

實驗細(xì)菌及實驗動物: ①綠膿桿菌: 系熒光標(biāo)記綠膿桿菌，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科宋元林教授贈予；②實驗動物: C57BL/6(17.8～26.25 g)小鼠，SPF級，購買于陸軍軍醫(yī)大實驗動物中心。

二、研究方法

1. ATF3在綠膿桿菌致ALI中的作用： 用經(jīng)鼻滴注的方法，以熒光標(biāo)記的濃度綠膿桿菌菌液(1.5×108PFU/ml，50 μl)建立小鼠綠膿桿菌誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠模型，同時用生理鹽水作為陰性對照。采用組織切片和HE染色觀察肺組織病理變化；通過肺泡灌洗液(BALF)中的蛋白含量、肺組織干濕比測定肺微血管通透性和肺水腫程度變化；qRT-PCR檢測ATF3在野生型急性肺損傷小鼠肺組織中的表達(dá)規(guī)律。

2. 實驗設(shè)計和急性肺損傷小鼠模型的建立

(1)觀察ATF3在WT小鼠中綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI中的表達(dá)規(guī)律： 按照隨機數(shù)字表法隨機分組。首先將小鼠隨機分為2組，分別為：野生型小鼠對照組(WC組，即給予野生型小鼠生理鹽水)、野生型小鼠急性肺損傷組(WA組，即給予野生型小鼠經(jīng)鼻滴入綠膿桿菌)。PA給予后0、3、6、12 h及24 h(每個時相點5只小鼠) 處理小鼠。

配制綠膿桿菌菌液： 將原始菌種從-80 ℃冰箱取出解凍后接種于哥倫比亞血平板，普通三區(qū)劃線后放置于37 ℃孵箱中24 h后長出大量菌落。用接種環(huán)取適量1～2個菌落至于無菌生理鹽水中，用DL-ZD1濁度計調(diào)至0.5個麥?zhǔn)蠁挝?，相?dāng)于1.5×108cfu/ml(方法來源：引自衛(wèi)生部規(guī)范教材《微生物學(xué)和微生物檢驗》第二版)。

將小鼠置于秤盤中稱重。

麻醉小鼠： 取一朵醫(yī)用棉球沾少許乙醚，并置于密閉的燒瓶內(nèi)，然后將小鼠放入燒瓶內(nèi)約20 s左右，見小鼠被麻醉后即取出小鼠，進(jìn)行后續(xù)滴鼻操作。在用乙醚麻醉的過程中需掌握好麻醉時間，若麻醉時間過短則在后續(xù)操作過程中小鼠較活躍不易滴鼻操作，若麻醉時間過長則小鼠容易死亡。

綠膿桿菌/生理鹽水滴鼻： 用左手抓住被乙醚麻醉后的小鼠背頸部，頭部垂直向上，右手用10 μl移液器將綠膿桿菌菌液(以1.5×108cfu/ml的濃度)或生理鹽水共50 μl滴鼻以吸入至肺內(nèi)，滴注過程中可見小鼠鼻孔處有氣泡產(chǎn)生，但嘴內(nèi)無液體流出，表明綠膿桿菌經(jīng)過呼吸道到達(dá)小鼠肺內(nèi)。為利于吸入液體肺內(nèi)分布，滴完后小鼠垂直放置約5 min，并用白熾燈加熱保暖。

麻醉小鼠： 按綠膿桿菌作用時間設(shè)置處理時間點，左手抓住背頸部皮膚，固定小鼠頭部，小指夾住尾巴，以45 ℃方向進(jìn)針按戊巴比妥250 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射以麻醉小鼠。

肺泡灌洗： 待麻醉成功后，將小鼠固定于處理板上，解剖頸部，暴露氣管，在氣管上端剪一小口，置入自制氣管導(dǎo)管，用1 ml生理鹽水反復(fù)灌洗 3次，留取灌洗液約0.7～0.8 ml左右于EP管中，做好標(biāo)記，置于-80 ℃冰箱備用。

收集標(biāo)本： 固定小鼠于處理板上，打開胸腔，暴露肺臟組織，小心取下肺臟組織，右上肺用于提取蛋白，左肺用于提取RNA。

(2)檢測肺泡灌洗液中總蛋白含量: 用微量白蛋白測定試劑盒(鄰苯三酚紅比色法)測定肺泡灌洗液中總蛋白含量。

(3)肺組織干濕比: ①將移除的左肺立即用電子天平稱重為濕重；②烘烤箱內(nèi)60 ℃下放置72 h至重量不在變化稱重為干重。

(4)小鼠肺組織病理檢測: 小鼠處理及實驗分組同前。

肺組織石蠟包埋及切片：①酒精脫水：將肺組織從4%PFA中取出進(jìn)行梯度酒精脫水：75%乙醇、80%乙醇、90%乙醇分別脫水30 min，100%乙醇脫水兩次，每次30 min;②脫水透明：將肺組織置于透明劑二甲苯中進(jìn)行透明兩次，每次30 min，以脫出組織中酒精;③浸蠟與包埋：將已透明的肺組織置于已溶化的石蠟中，隨之放入60 ℃烤箱中。待肺組織完全浸于石蠟后，用石蠟包埋機進(jìn)行包埋。放置于4 ℃冰箱過夜，待冷卻凝固成塊;④切片：將包埋好的蠟塊固定于切片機上，用切片機切成薄片，切片厚度約為5 μm。

HE染色： ①將切下的薄片貼到載玻片上，置于45 ℃恒溫箱中烘干；②脫蠟：染色前使用二甲苯脫蠟2次，每次10 min；③由高到低濃度酒精梯度水化：分別于100%酒精，100%酒精，95%酒精，95%酒精水化各10 min，最后用ddH2O沖洗；④蘇木素水溶液中染色3 min，用ddH2O沖洗3 min；⑤用0.5%鹽酸酒精分色20 s，ddH2O沖洗1 min；⑥用0.5%伊紅染色3 min，ddH2O沖洗2 min；⑦60 ℃恒溫箱中將切片烘干，過夜; ⑧經(jīng)純酒精脫水、二甲苯透明后的切片，滴上中性樹膠，蓋上蓋玻片封片，顯微鏡觀察切片。

肺損傷評分按照以下三項標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行: ①肺泡和間質(zhì)水腫；②肺泡出血；③中性粒細(xì)胞浸潤或聚集。每項標(biāo)準(zhǔn)又分四個等級：0=正常，1=輕度變化，2=中度變化，3=重度變化。最終的肺損傷得分為：三項標(biāo)準(zhǔn)評分的總和(總分為9)。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、鏡下熒光標(biāo)記的綠膿桿菌

鏡下熒光標(biāo)記的綠膿桿菌，見圖1。

二、肺泡灌洗液總蛋白含量結(jié)果

1. WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺泡灌洗液總蛋白含量： 為了證實ALI造模是否成功，我們用微量總蛋白試劑盒(鄰苯三酚紅比色法)測定肺泡灌洗液中總蛋白含量。用WT小鼠吸入綠膿桿菌后3 h肺泡灌洗液中總蛋白開始升高，于6 h出現(xiàn)高峰，與空白組存在顯著差異(P<0.05)，提示肺微血管通透性增加，見圖2。

2. ATF3對綠膿桿菌致急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量的影響： 本實驗提示W(wǎng)T小鼠(WA組)吸入綠膿桿菌后肺泡灌洗液中總蛋白明顯增加，較空白組、WC組重，說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺微血管通透性增加，肺水腫程度加重。WA組較對照組及其他各組的結(jié)果存在顯著差異(P<0.05)，見圖3。

圖1 熒光標(biāo)記的綠膿桿菌(100×)；圖2 WT小鼠吸入綠膿桿菌肺泡灌洗液總蛋白含量的時間梯度(a,b,c,P<0.05)；圖3 WT小鼠肺泡灌洗液總蛋白含量對比(a,b,c,P<0.05)

3. 肺組織干濕比結(jié)果: 為了進(jìn)一步明確ATF3對綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI中肺水腫程度的影響，我們對肺組織干濕比進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，空白組的濕干比為11.76±0.404， WC組為11.615±0.414，WA組為13.25±0.216。本實驗提示吸入綠膿桿菌的的WA組肺組織干濕比增加，較空白組、WC組均重，說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺水腫程度加重。WA組較對照組及其他各組的結(jié)果有顯著差異(P<0.05)。肺組織干濕結(jié)果與肺泡灌洗液中蛋白濃度結(jié)果相一致。

4. HE染色: 肺組織病理切片HE染色結(jié)果顯示，在WT小鼠吸入生理鹽水組(WC組)的肺泡間隔無明顯增厚，肺泡腔無明顯滲出，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，與正常小鼠肺組織病理切片相比無明顯差異，圖4A。在吸入綠膿桿菌后6 h后，WT小鼠吸入綠膿桿菌組(WA組)肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡間隔增厚、中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡出血以及肺間質(zhì)水腫，呈現(xiàn)為典型的急性肺損傷病理變化。按照實驗方法部分的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺組織損傷病理評分，結(jié)果顯示W(wǎng)A組的得分高于WC組，見圖4B。

圖4 小鼠肺病理學(xué)檢查(HE×100)；注：A：為WT小鼠滴入生理鹽水(WC組)；B：為WT小鼠滴入綠膿桿菌(WA組)

5. WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺組織ATF3 相對表達(dá)時間梯度： 為明確ATF3在WT小鼠急性肺損傷肺組織中的表達(dá)規(guī)律，用qRT-PCR檢測WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺組織ATF3 mRNA表達(dá)，于0、3 h、6 h、12 h及24 h時相點分別為1.006±0.136，9.954±0.624，4.578±1.463，2.342±0.122，3.249±0.680，結(jié)果顯示ATF3 mRNA于3 h達(dá)高峰，較0，6 h、12 h、24 h存在顯著差異(P<0.05)，見圖5。

討 論

ALI/ARDS是由炎癥失控而引起頑固性低氧血癥和嚴(yán)重呼吸困難為突出表現(xiàn)的臨床危急重癥[1]。綠膿桿菌是引發(fā)膿毒血癥常見致病菌之一，亦是引發(fā)ALI的常見病因。多年研究表明ALI/ARDS本質(zhì)是炎癥反應(yīng)失控，最終導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)而促發(fā)ALI/ARDS，但其發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今尚不完全明確。故需深入探索ALI機制并針對炎癥信號通路以尋找一個新的基因治療靶點。

圖5 WT小鼠吸入綠膿桿菌肺組織中ATF3mRNA相對表達(dá)規(guī)律(a，b，c，d，P<0.05)

ATF3是新近發(fā)現(xiàn)的TLR4信號通路中的一個具有負(fù)性調(diào)控作用的炎癥調(diào)控因子。ATF3屬ATF/CRB(the activating transcription factor, ATF/cyclic AMP response element-binding, CREB)家族成員，它屬于應(yīng)激早期快反應(yīng)基因，在正常情況下于細(xì)胞內(nèi)低水平穩(wěn)定表達(dá)，但在各種應(yīng)激信號(如炎癥、氧化應(yīng)激、缺血缺氧等)刺激后其表達(dá)水平能迅速顯著提高。文獻(xiàn)報道，ATF3廣泛參與多種細(xì)胞活動的調(diào)控，許多疾病的發(fā)生發(fā)展均存在ATF3表達(dá)上調(diào)的適應(yīng)性反應(yīng)[13-19]。關(guān)于ATF3在綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI作用及機制的研究中，鮮有報道。

既往文獻(xiàn)報道，在膿毒血癥免疫抑制階段，ROS可誘導(dǎo)ATF3表達(dá)增加，從而抑制IL-6等細(xì)胞因子生成，導(dǎo)致繼發(fā)感染的敏感性增加[20]。在小鼠巨噬細(xì)胞中，ATF3能與巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β(CCL4)啟動子ATF/CRE位點結(jié)合抑制巨噬細(xì)胞CCL4的表達(dá)和分泌，控制過度的炎癥反應(yīng)[21]。ATF3對呼吸機相關(guān)性肺損傷(ventilator induced lung injury, VILI)亦有保護(hù)作用，ATF3通過降低機械通氣產(chǎn)生的環(huán)切力(CS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對肺損傷有保護(hù)作用，能抗衡環(huán)切力和高通氣帶來的炎癥[22]。上述結(jié)果均提示ATF3可降低炎癥反應(yīng)，證實了ATF3對炎癥反應(yīng)有“剎車” 作用，是TLR4信號通路中重要的負(fù)性調(diào)控基因。由此，我們有理由相信上調(diào)ATF3的表達(dá)對急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用。

為了評價ATF3的表達(dá)對綠膿桿菌致ALI小鼠的影響，我們先比較了WT小鼠吸入綠膿桿菌(WA組)、生理鹽水(WC組)后與對照組的肺泡灌洗液中總蛋白、肺組織干濕比和肺組織病理改變。實驗結(jié)果顯示，吸入綠膿桿菌的WT小鼠(WA組)肺泡灌洗液中，于6 h時相點肺泡灌洗液總蛋白出現(xiàn)高峰，肺泡灌洗液總蛋白含量較WC組、對照組明顯增加，肺組織干濕比明顯加重，肺組織炎癥病理改變明顯(大量中性粒細(xì)胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡出血及肺間質(zhì)水腫)。上述研究結(jié)果說明WT小鼠吸入綠膿桿菌后肺微血管通透性增加，肺水腫程度加重，均提示經(jīng)鼻滴入綠膿桿菌致急性肺損傷模型構(gòu)建成功。PA菌液感染滴度為：1.5×108CFU/ml(相當(dāng)于0.5個麥?zhǔn)蠁挝?，符合實驗要求。上述研究結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致[23-24]。

本研究以往Western blot試驗揭示[25]，WT小鼠吸入生理鹽水及綠膿桿菌均能誘導(dǎo)ATF3蛋白表達(dá)明顯增加，其中生理鹽水組在3 h時相點達(dá)最高峰，綠膿桿菌組在3 h、24 h時相點達(dá)最高峰，其中24 h較3 h峰值還高，均較空白組存在顯著差異。為再次印證ATF3的表達(dá)規(guī)律，本實驗結(jié)果顯示，吸入綠膿桿菌后可誘導(dǎo)ATF3 mRNA表達(dá)增加，在3 h時相點達(dá)最高峰，24 h時相點基本回到正常水平，結(jié)果與前期預(yù)實驗及文獻(xiàn)報道相一致[26-27]，與Western blot試驗[25]結(jié)果基本一致。再次證實了ATF3在應(yīng)激信號出現(xiàn)后其mRNA水平能迅速提高這一現(xiàn)象，即存在ATF3表達(dá)上調(diào)的適應(yīng)性反應(yīng)[13-19]。本研究既往實驗已證實[28]，吸入綠膿桿菌的ATF3敲基因小鼠巨噬細(xì)胞釋放多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α的量出現(xiàn)明顯增加，于3 h達(dá)高峰，且明顯高于WT小鼠及對照組的表達(dá)，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報道的LPS所致肺部炎癥反應(yīng)時相點相一致[23-24,27,29-30]。本實驗中ATF3mRNA表達(dá)高峰在WT小鼠吸入綠膿桿菌后的3 h，與ATF3敲基因小鼠炎癥因子釋放高峰時相點相一致，并隨之逐漸下降，且各種炎癥因子表達(dá)高峰在吸入綠膿桿菌后的敲基因小鼠中表達(dá)明顯高于WT小鼠，提示ATF3在綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI小鼠中能夠抑制炎癥因子的表達(dá)，是一個具有負(fù)性調(diào)控的適應(yīng)性基因。為研究ATF3調(diào)控ALI的機制，我們既往采用了Western blot方法檢測了NF-κB在小鼠肺組織的活性表達(dá)，實驗結(jié)果已證實了TLR4/NF-κB信號通路可能是ATF3負(fù)性調(diào)控ALI的信號通路之一[25]，與文獻(xiàn)報道一致[23-24,27,29-30]。

綜上所述，本實驗通過分析綠膿桿菌致急性肺損傷中ATF3的表達(dá)規(guī)律，提示上調(diào)ATF3能負(fù)性調(diào)控綠膿桿菌誘導(dǎo)的ALI的肺組織炎癥損傷，即ATF3對過激炎癥反應(yīng)有負(fù)性調(diào)控作用，再次證實了ATF3作為負(fù)性調(diào)控基因?qū)G膿桿菌致ALI小鼠可能有一定保護(hù)作用。故上調(diào)ATF3的表達(dá)可能為治療ALI提供了新的治療靶點。