康冬柳 ，邢江峰 ，胡愛明 ，張付華 ，徐俊杰 ，文明華

（1.吉安市畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343000；2.北京一立科技公司；3.九江市畜牧獸醫(yī)局；4.南昌市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心；5.宜春市畜牧水產(chǎn)局；）

目前市級(jí)以下動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)由于設(shè)備、人員的缺乏，技術(shù)水平較低，造成多數(shù)動(dòng)物疫病在基層不能及時(shí)檢測(cè)和診斷，有些疫病或樣本在基層無法開展病原學(xué)檢測(cè)，從而造成動(dòng)物疫病的處置延遲和病原擴(kuò)散，給養(yǎng)殖業(yè)造成損失甚至發(fā)生人畜共患病。因此，如何快速診斷動(dòng)物疫病、“早快嚴(yán)小”控制動(dòng)物疫情成為我們亟需解決的關(guān)鍵問題。

借鑒國內(nèi)外先進(jìn)技術(shù)，我們探索建立了一套針對(duì)基層動(dòng)物疫病檢測(cè)診斷的技術(shù)手段和解決方案，開發(fā)研究適合基層動(dòng)物疫病檢驗(yàn)診斷的技術(shù)平臺(tái)。技術(shù)平臺(tái)可根據(jù)具體地區(qū)研發(fā)不同疫病、項(xiàng)目的檢測(cè)試劑盒，簡化操作步驟和設(shè)備，靈敏度和操作性比現(xiàn)有試劑更優(yōu)。從而實(shí)現(xiàn)只需有PCR儀及常見設(shè)備、耗材，就能在市級(jí)以下動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)甚至養(yǎng)殖場、流動(dòng)診斷車上都能開展病原學(xué)檢測(cè)的動(dòng)物疫病診斷新局面。同時(shí)由于優(yōu)化了檢測(cè)方法，減少了操作步驟，具有實(shí)驗(yàn)操作水平的工作人員可直接使用，或者沒有操作水平的工作人員可在極短期的培訓(xùn)后可直接上崗，解決了實(shí)驗(yàn)室專業(yè)人員不足的困難。

1 技術(shù)平臺(tái)簡介

隨著分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)也得到了越來越廣泛的應(yīng)用。在遺傳病檢測(cè)、個(gè)體化用藥檢測(cè)、病原體檢測(cè)等領(lǐng)域qPCR技術(shù)已經(jīng)成為不可或缺的基本技術(shù)?，F(xiàn)在傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是使用柱提法或磁珠法先從檢測(cè)樣本中將核酸提取出來，然后將提取好的核酸加入到配置好的PCR反應(yīng)液里，這種傳統(tǒng)的熒光PCR方法需要人工干預(yù)的步驟較多，而且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求也高，整個(gè)反應(yīng)流程需要4～6h。

我們建立的直擴(kuò)qPCR技術(shù)平臺(tái)（POCT qPCR），使用1st TECH核酸定向釋放劑10min即可完成樣本中DNA和RNA的釋放，同時(shí)可將樣本中干擾qPCR反應(yīng)效率的物質(zhì)凝固；釋放后的核酸樣本可以直接加入PCR反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)，將qPCR檢測(cè)縮短至60min左右。

同時(shí)我們還建立了一種即用型qPCR的反應(yīng)體系，省去了配置PCR反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)過程，與1st TECH核酸定向釋放劑配合使用可以使qPCR反應(yīng)操作更簡單。

2 技術(shù)平臺(tái)優(yōu)勢(shì)

核酸提取方法和傳統(tǒng)的核酸提取方法的比較：

3 應(yīng)用

3.1 我們將該技術(shù)平臺(tái)初步應(yīng)用于動(dòng)物H7N9的病原學(xué)監(jiān)測(cè)和篩查，完成監(jiān)測(cè)任務(wù)5 000余份次，具有設(shè)備簡化、步驟簡單、操作方便、靈敏度高等特點(diǎn)，非常適合市級(jí)以下基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)應(yīng)用。

3.2 該技術(shù)平臺(tái)可用于多種類型樣本的檢測(cè)

①血液樣本：全血樣本、血清、血漿、指尖血；

②分泌物樣本：口腔拭子、咽拭子、肛拭子、生殖道分泌物或拭子、動(dòng)物咽拭子；

③組織或細(xì)胞樣本：組織研磨上清液、細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)菌或病毒培養(yǎng)物。

3.3 可根據(jù)具體地區(qū)、具體病種繼續(xù)研發(fā)不同疫病、項(xiàng)目的檢測(cè)試劑盒。

3.4 可用于樣本中RNA和DNA的檢測(cè)，國內(nèi)同類產(chǎn)品只能進(jìn)行DNA的檢測(cè)。我們可以將傳統(tǒng)qPCR的檢測(cè)時(shí)間縮短至少1h以上，尤其適合于動(dòng)物疫病的快速篩查，在最短的時(shí)間內(nèi)就可以將結(jié)果上報(bào)，為正確的處理疫情贏得了時(shí)間。