徐翠 ，陳慧婷 ，黎家祥 ，左明開 ，陳良榮 ，黃冬艷 ，花象柏

（南昌珠安生物技術(shù)有限公司，江西 南昌 330013；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

1 病料來源與檢測方法

1.1 病料來源

從2016年7月至2018年6月兩個(gè)非自然年度，共在江西省大、中、小不同規(guī)模的豬場409戶次，收集病料1 304頭份。這些病料絕大部分是筆者所在團(tuán)隊(duì)的執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師應(yīng)邀前往上述豬場出診，選擇發(fā)病典型的豬只現(xiàn)場剖檢采集。到達(dá)現(xiàn)場后，先詳細(xì)詢問病史，后進(jìn)入豬舍觀察病豬的臨床癥狀，最后選擇該次發(fā)病有代表性的病豬1至數(shù)頭剖檢，記錄剖檢變化，拍攝病變器官圖片。所取病料1頭豬作為1頭份，通常包括扁桃體、肺臟、脾臟、肝臟和腎臟等器官及頜下、腹股溝、腸系膜和肺門等部位淋巴結(jié)的組織各少許，裝入自封袋中，貼上標(biāo)簽。如臨床初診見有神經(jīng)癥狀的，加取大腦、小腦和嗅球等腦組織；見有腹瀉或腸道有明顯病變者，加取小腸和大腸等組織。這些病料均一式兩份，一份南昌株安生物有限公司實(shí)驗(yàn)室檢測，一份備用或送其他實(shí)驗(yàn)室檢測會(huì)診。疑難細(xì)菌性病例，帶培養(yǎng)基至現(xiàn)場接種。疑難病例，帶固定液現(xiàn)場取病理組織固定切片觀察。少部分病料由豬場獸醫(yī)人員，經(jīng)與本團(tuán)隊(duì)執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師溝通，自行采集送來，病毒性疾病病料亦可冰凍后寄送過來。

1.2 檢測方法

1.2.1 病毒類

1.2.1.1 主要試劑與儀器。飽和酚、氯仿、異丙醇、無水乙醇、RNAiso Plus、Proteinase K、2*Taq PCR MasterMix(with Dye)和DL2000 Marker等均購自寶生物工程（大連）有限公司。超凈臺(tái)，PCR擴(kuò)增儀和高速離心機(jī)等。

樣品處理及核酸抽提。根據(jù)RNAiso Plus的使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)GenBank登錄的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），豬瘟病毒（CSFV），偽狂犬病病毒（PRV），豬圓環(huán)病毒 2型（PCV2），豬流行性腹瀉病毒（PEDV）,豬丁型冠狀病毒（PDCoV），豬圓環(huán)病毒 3型（PCV3），豬捷申病毒（PTV），豬細(xì)小病毒（PPV）,日本乙型腦炎病毒（JEV）,豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（PoRV）的基因序列，用oligo6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1.3 核酸檢測。病毒的擴(kuò)增以上步抽提好的總產(chǎn)物為模板，用TaKaRa one Step RNA PCR Kit試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，RNA病毒如PRRSV，CSFV，PEDV等進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)條件 RT：37℃ 15 min，85℃ 5 s;PCR:94℃ 5 min，（94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 45 s）×35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min；DNA病毒如 PRV，PCV2等進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃5min，（94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 45s）×35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 細(xì)菌類。無菌采集病料，接種于TSA培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng) 24h。

1.2.3 病理切片。常規(guī)石蠟切片和H-E染色，光鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 全部檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

自2016年7月至2018年6月，兩個(gè)非自然年度各病原的陽性檢出率如下：病毒類：PRRSV為63.7%（497/780）,PCV2 為 89.3%（475/532）,PRV 為11.6%（47/404）,CSFV 為 7.2%（32/446）,PEDV 為28.4%（119/419），PDCoV 為 34.9%（15/43）,PCV3 為37.5%（3/8）,PTV 為 43.3%(13/30),PPV 為 15.4%（4/26）,JEV為2.6%（1/38）,未檢出TGEV和 PoRV。細(xì)菌類：豬丹毒桿菌為66.7%（4/6）,副豬嗜血桿菌為22.2%（4/18）,豬副傷寒沙門氏菌為 100%（3/3），豬鏈球菌為53.1%（17/32）。

2.2 混合感染的統(tǒng)計(jì)

依據(jù)2.1所示的全部病原檢測結(jié)果，可知PRRSV,PCV2和PEDV等3種病原檢出率較高，故混合感染情況統(tǒng)計(jì)，分別以這3種病原為基礎(chǔ)感染來進(jìn)行。

2.2.1 以PRRSV為基礎(chǔ)感染，見表1。

表1 PRRSV與其他病毒混合感染情況

表2 PEDV與其他病毒混合感染情況

2.2.2 以PEDV為基礎(chǔ)感染，見表2。

2.2.3 以PCV2為基礎(chǔ)感染，二重感染為CSFV,或PRV的陽性檢出率分別為2.3%(12/532),或0.6%(3/532)。

3 小結(jié)與討論

3.1 自2016年7月至2018年6月兩個(gè)非自然年度的豬病病原檢測結(jié)果表明，檢測病例數(shù)較多且檢出率較高的是PRRSV,PCV2和PEDV等3種病原。說明全省各類型豬場危害嚴(yán)重的豬病是以PRRSV為病原的藍(lán)耳病，以PCV2為病原的圓環(huán)病毒病和以PEDV為主要病原的低日齡仔豬腹瀉。由于豬場藍(lán)耳病疫苗接種情況為少數(shù)未接種，多數(shù)為接種不規(guī)范，或病原類型發(fā)生變化，導(dǎo)致PRRSV檢出率高。由它導(dǎo)致的豬體免疫功能降低，可繼發(fā)多種其他豬的病原感染，尤其是PCV2的繼發(fā)，使這種二重感染

檢出率達(dá)25.1%（196/780）[1]，盡管絕大多數(shù)豬場都接種了PCV2型疫苗。事實(shí)上，這種二重感染已成為豬場普遍存在的問題，并導(dǎo)致了豬場嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2017年7月，江西余江一養(yǎng)殖戶，因多年未對(duì)其飼養(yǎng)的豬群接種藍(lán)耳病疫苗，結(jié)果暴發(fā)類似2006年下半年普遍發(fā)生的那種藍(lán)耳病，損失慘重。采取該場4頭病死豬的病料檢測證實(shí)PRRSV、PCV2、PRV和CSFV均為陽性，構(gòu)成四重感染，盡管后3種病原引起的豬病均接種了疫苗，這種情況是較為罕見的。

3.2 本報(bào)告結(jié)果中列出了PTV的檢出，值得一提的是該病原的檢出過程。2017年5月，我省一大型法系純種豬場50 d以上的保育豬發(fā)生一種類似藍(lán)耳病的豬病，但病料經(jīng)針對(duì)PRRSV的RT-PCR檢測結(jié)果并不支持藍(lán)耳病的臨床初診。病理切片觀察揭示了該病的端倪。病料經(jīng)針對(duì)PTV的PCR檢測，并通過測序確定為PTV，于是明確了該場所發(fā)豬病是捷申病，屬我省首次報(bào)道[2]。

3.3 自2010年以來，全國各地先后發(fā)生發(fā)病與致死率均極高的低日齡（2～5 d）仔豬腹瀉。該病的一個(gè)特點(diǎn)是一種針對(duì)PEDV的疫苗在不同的發(fā)病豬場使用，效果不盡相同，引發(fā)思考。經(jīng)過對(duì)本報(bào)告中報(bào)道的相關(guān)PEDV的混合感染的多量檢測分析，初步認(rèn)為下列因素左右了該病的防控。一是：病原的多樣性，不只是PEDV,還存在PDCoV及其兩者的混合感染；二是：發(fā)病誘因（或混合感染）為PRRSV、PCV2、PRV和CSFV的一個(gè)或多個(gè)存在于該病當(dāng)中[3]；從而增加了低日齡仔豬腹瀉的防控難度,也為防控低日齡仔豬腹瀉找到了更好的途徑。

3.4 本報(bào)告中一些檢測病例數(shù)較少或檢出率較低的病原，原因各不相同。由于未接種疫苗，副豬嗜血桿菌病在實(shí)踐中發(fā)病很多，是藍(lán)耳病的一種重要繼發(fā)感染；但因其剖檢病變明顯，故被病理診斷確定；只是進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的病例才取病料檢測。豬丹毒在未接種疫苗的豬場發(fā)病也較多，但因用青霉素治療效果好，只是在反復(fù)發(fā)生的病例才取病料檢測確診。豬副傷寒沙門氏菌多年來已淡出人們的視線，疫苗亦不再使用；但近來剖檢時(shí)見到一些大腸粘膜發(fā)生糠麩樣壞死的病例，病料檢測證實(shí)為副傷寒沙門氏菌，應(yīng)引起重視。豬鏈球菌是在未應(yīng)用疫苗或應(yīng)用疫苗后發(fā)病才進(jìn)行檢測，后者分離菌血清型鑒定證實(shí)疫苗中確實(shí)沒有包含所檢測到的血清型。PPV、JEV和TGEV等所引起的豬病因疫苗的使用得到了有效的控制。PCV3和PTV（目前均無該兩種相關(guān)疫苗）檢出少，PoRV（未接種該疫苗）未檢出，則反映了它們真實(shí)的發(fā)病情況。CSFV和PRV兩種疫苗都是豬場的常規(guī)免疫，CSFV的少量檢出由各種因素導(dǎo)致的免疫失敗所致，PRV的少量檢出則可能與PRV病原變異有關(guān)。