張 林， 葉紅玲*， 姚 軍， 徐基艷

(1. 安慶職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林園藝系，安徽 安慶 246003；2. 安慶市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 安慶 246000)

藍(lán)莓是天然花青素的優(yōu)質(zhì)來源，藍(lán)莓鮮果中花青素含量高于其它果蔬[1]。大量研究表明，藍(lán)莓花青素具有抗氧化、抗心血管疾病、預(yù)防眼疾等多種功效[2-4]，在食品藥品和化妝品領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。自2008年以來，我國藍(lán)莓種植業(yè)迅速發(fā)展，北起黑龍江，南至海南，東起渤海之濱，西至西藏高原，全國規(guī)?；N植的省、直轄市達(dá)到27個(gè)。2004年以來，安徽懷寧在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的幫助下開啟了藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化種植之旅，截至2018年4月，全縣累計(jì)種植面積超過2.3萬畝。懷寧縣人民政府印發(fā)了《安徽省懷寧縣藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016～2025)》，規(guī)劃至2020年，全縣藍(lán)莓種植面積不少于5萬畝，并形成年消納藍(lán)莓鮮果7.5萬噸及加工15萬畝藍(lán)莓鮮果的深加工能力。

藍(lán)莓鮮果50%以上用于深加工[5-6]，產(chǎn)品包括藍(lán)莓果汁、果酒、果醋、果醬、酵素等，藍(lán)莓深加工成液體產(chǎn)品產(chǎn)生大量廢棄物(果渣)，而果渣中花青素含量較豐富[7-9]，但其綜合利用程度卻很低，導(dǎo)致了資源浪費(fèi)[10]。本文以藍(lán)莓果渣為原料，通過纖維素酶水解法提取果渣中花青素[11]，操作簡單易行、生產(chǎn)工藝參數(shù)易控制，相對(duì)于超聲波和微波法等方法提取果渣花青素[12-13]，生產(chǎn)成本明顯降低，且提取花青素后的酶解液仍可用于其它藍(lán)莓副產(chǎn)品的加工，充分提高了果渣的利用率。研究成果旨在為當(dāng)?shù)丶捌渌貐^(qū)藍(lán)莓種植、加工企業(yè)提高藍(lán)莓加工廢棄物的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

藍(lán)莓果渣由安慶市錦華藍(lán)莓有限公司提供(2017年7月采集的兔眼藍(lán)莓和南方高叢藍(lán)莓的成熟果實(shí)，1∶1混合后榨汁剩余果渣)；纖維素酶(食品級(jí),南寧龐博生物工程有限公司出品)；矢車菊3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司出品，批號(hào)：20170217)；其它試劑均為分析純，購于國藥試劑公司。

AUY120型電子精密天平(日本島津公司)；SP-723可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；HWS-24數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 樣品預(yù)處理方法

果渣經(jīng)恒溫干燥至恒重、粉碎后過80目篩，篩下果渣粉用于花青素提取試驗(yàn)[14-15]。

1.3 單因素試驗(yàn)

稱取1 g藍(lán)莓果渣粉，移入pH 4.8的水溶液浸提，設(shè)定料液比1∶15 (g/mL)、浸提溫度為50 ℃，纖維素酶的添加量為10 FPU/g果渣，提取時(shí)間為24 h，固定其它條件，以提取液中花青素含量為指標(biāo)，依次進(jìn)行下列單因素條件篩選：提取液中酸的種類(蘋果酸、檸檬酸、甲酸、鹽酸)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50)、提取時(shí)間(6、12、18、24、30、36、42、48 h)、纖維素酶的添加量(20、30、40、50、60、70、80 FPU/g果渣)。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇提取液中酸化劑的種類、料液比、纖維素酶的添加量、提取時(shí)間為影響因素，每個(gè)因素分別選取3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表1)。

1.5 花青素提取量測定

酶解結(jié)束后，過濾收集酶解液即為花青素粗提液。采用雙波長pH示差法，以矢車菊3-O-葡萄糖苷為參照。各吸取1 mL花青素粗提液于2支10 mL比色管中，分別加入9 mL pH=4.5 NaAc-HAc緩沖溶液(0.4 mol/L)和9 mL pH=1.0的KCl-HCl溶液(0.25 mol/L)，渦旋混合后，倒入1 cm比色皿，分別在510 nm和700 nm處測定吸光值，蒸餾水代替樣品做空白對(duì)照，花青素的提取量按公式(1)計(jì)算[16]。

(1)

式中：A=(A510 nm, pH=1.0-A700 nm, pH=1.0)-(A510 nm, pH=4.5-A700 nm, pH=4.5)；M為矢車菊3-O-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，449.21 g/mol；K為溶液稀釋倍數(shù)；ε為矢車菊3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26 900 L/(mol·cm)；L為比色皿光程，1 cm。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酸化劑種類對(duì)花青素提取量的影響 固定單因素試驗(yàn)中其它條件，分別以檸檬酸、蘋果酸、甲酸和鹽酸為酸化劑，將浸提水溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.8，果渣經(jīng)酶解后測定花青素提取量。從圖1中可以看出，不同酸化劑對(duì)花青素提取量的大小順序?yàn)椋杭姿?鹽酸>檸檬酸>蘋果酸，且甲酸和鹽酸對(duì)花青素的提取效果優(yōu)于檸檬酸和蘋果酸。其中以甲酸和鹽酸為酸化劑時(shí)，果渣中花青素的提取量分別為1.70 mg/g和1.68 mg/g。故選擇檸檬酸、甲酸、鹽酸進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖1 酸化劑對(duì)花青素提取效果的影響Fig.1 Effects of acidulants on the extraction of anthocyanin

2.1.2 料液比對(duì)花青素提取量的影響 從圖2可看出，鹽酸酸化后的提取劑，其料液比由1∶10增至1∶35時(shí)，花青素提取量與料液比呈正相關(guān)。料液比在1∶35～1∶45時(shí)，花青素的提取量增加不明顯，當(dāng)料液比擴(kuò)大到1∶50時(shí)，花青素提取量反而下降，可能是料液比過度增大，稀釋了酶濃度，減少了酶和底物接觸的機(jī)會(huì)。從生產(chǎn)的角度出發(fā)，選擇料液比1∶35的花青素提取量最大，此時(shí)花青素提取量為2.09 mg/g。

圖2 料液比對(duì)花青素提取效果的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio on the extraction of anthocyanin

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響 以鹽酸為酸化劑，料液比選擇1∶35，考查不同提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響(圖3)。提取時(shí)間由6 h延長至24 h，花青素提取量隨提取時(shí)間的延長而增加，提取時(shí)間為24 h時(shí)，提取效果最佳，每克果渣可提取花青素2.66 mg。當(dāng)提取時(shí)間超過24 h直至48 h時(shí)，花青素提取量不再顯著增加，這可能是酶的效率已經(jīng)充分利用或果渣中花青素提取已經(jīng)較完全。因此選擇提取時(shí)間為24 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花青素提取效果的影響Fig.3 Effects of extraction time on the extraction of anthocyanin

2.1.4 酶添加量對(duì)花青素提取量的影響 以鹽酸為酸化劑，料液比選擇1∶35(g/mL)，提取時(shí)間定為24 h，考查纖維素酶不同添加量對(duì)花青素提取量的影響。如圖4所示，當(dāng)纖維素酶的添加量達(dá)到50 FPU/g果渣后，持續(xù)增加纖維素酶的用量，花青素的提取量不再增加，這可能是因?yàn)榈孜镆驯幻赋浞址纸猓ㄇ嗨匾呀?jīng)完全釋放。為了節(jié)約成本，避免造成酶制劑的浪費(fèi)，選擇酶的添加量為50 FPU/g果渣。

圖4 酶添加量對(duì)花青素提取效果的影響Fig.4 Effects of enzyme dosage on the extraction of anthocyanin

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，4個(gè)因素中極差最大的是A因素(酸化劑種類)，極差最小的是D因素(提取時(shí)間)。4個(gè)因素對(duì)花青素提取量影響由大到小順序?yàn)椋核峄瘎┓N類>料液比>酶的添加量>提取時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B3C1D2，按此方案進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，花青素提取量為2.84 mg/g果渣。在正交試驗(yàn)9組組合中，第8組試驗(yàn)方案最優(yōu)，花青素提取量為2.82 mg/g。比較這兩組試驗(yàn)組合，花青素提取量較為接近，但第一種方案料液比較大，增加了后期濃縮成本，從生產(chǎn)角度考慮，推薦酶解法提取花青素最佳條件為：調(diào)節(jié)提取水溶液pH 4.8、料液比1∶35(g/mL)、每克果渣添加40 FPU纖維素酶、保溫酶解36 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal experiment

續(xù)表2Table 2 Continued

3 結(jié)論與討論

田密霞等曾對(duì)60種藍(lán)莓鮮果中花青素含量進(jìn)行檢測[17]，發(fā)現(xiàn)不同品種藍(lán)莓鮮果中花青素含量差異明顯，最高含量可達(dá)8.69 mg/g鮮果，最低則為1.25 mg/g鮮果。而藍(lán)莓果渣中花青素含量的高低與原果品種、加工工藝有密切關(guān)系。本文通過單因素試驗(yàn)，比較了不同酸化劑、提取時(shí)間、纖維素酶的添加量和料液比對(duì)藍(lán)莓果渣中花青素提取效果的影響。在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)，確定纖維素酶水解藍(lán)莓果渣提取花青素的最佳提取工藝為：用鹽酸調(diào)節(jié)浸提水溶液pH至4.8，料液比1∶35(g/mL)，酶添加量為40 FPU/g果渣，50 ℃ 酶解36 h，此條件下花青素的提取量為2.82 mg/g果渣。酶法提取藍(lán)莓果渣花青素操作工藝簡便合理,較大程度地提高了藍(lán)莓資源的綜合利用率。