趙普生，韓 苗，熊子怡，郭 濤

(西南大學資源環(huán)境學院，重慶 400716)

長期定位肥料試驗，可以定向培育土壤質量和功能特點顯著不同的農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)，可以用作評價不同施肥方式對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的影響[1-2]。合理施用氮肥是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)高產(chǎn)、高效的基礎，硝化作用是全球氮素循環(huán)的重要中心環(huán)節(jié)，對土壤生態(tài)系統(tǒng)中氮平衡起決定性作用，因此對硝化作用的研究具有重要的農(nóng)學和環(huán)境意義[3-5]。

硝化作用是主要由微生物介導的反應，指在好氧條件下銨態(tài)氮被氧化為硝態(tài)氮的過程，它是由微生物所驅動的，分別由兩類化能自養(yǎng)微生物參與完成：首先是氨氧化微生物(Ammonia-oxidizing microorganisms,AOM)將氨氧化為亞硝態(tài)氮，再由亞硝酸氧化細菌(NOB)將亞硝態(tài)氮氧化為硝態(tài)氮，其中能將氨氧化為亞硝態(tài)氮的氨氧化微生物包括氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea,AOA)[4]。施肥制度的不同可導致土壤微生物數(shù)量和活性的不同，繼而影響土壤微生物的功能[6]。氨氧化微生物與硝化細菌作為硝化過程的主要參與者不可避免地會受其影響。賀紀正等[7]利用定量PCR和DGGE相結合方法，對我國湖南祁陽旱地長期定位試驗點酸性紅壤的研究結果顯示，長期施肥對土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌數(shù)量均有顯著影響，且對AOA的群落結構產(chǎn)生了巨大影響。Shen等[8]通過研究河南封丘堿性潮土發(fā)現(xiàn)，長期施肥對土壤AOB的數(shù)量和群落結構有顯著影響，而對AOA數(shù)量和群落結構未產(chǎn)生影響。長期不同施肥制度下黃土旱塬黑壚土AOA和AOB群落多樣性和豐度也產(chǎn)生了相應的變化[9-10]。

已有研究表明土壤的硝化作用與土壤pH值存在著顯著的相關性[11-12]，而在以往的研究中酸堿度為中性的土壤研究較少。因此以國家紫色土肥力與肥料效益監(jiān)測基地的中性紫色土為研究對象，進行土壤氨氧化細菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析，比較長期不同定位施肥對土壤氨氧化潛勢和硝化強度的影響，以期明確氨氧化微生物功能的變化是否響應微生物基因拷貝數(shù)的變化，并分析不同施肥制度對功能微生物豐度與功能的影響，為三峽庫區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中氮素循環(huán)的有效管理、提高肥料利用效率提供重要依據(jù)。這對于在中性紫色土區(qū)建立長效科學的施肥制度，改善紫色土的土壤質量和實現(xiàn)土壤可持續(xù)發(fā)展也具有重要的意義。

1材料與方法

1.1 試驗設計

國家紫色土土壤肥力與肥料效益監(jiān)測基地于1991年在重慶市北碚區(qū)建立，迄今已開展了25年連續(xù)定位試驗，試驗點位于重慶市北碚區(qū)西南大學教學農(nóng)場，試驗地地處東經(jīng)106°26′，北緯30°26′，年平均氣溫18.4℃，全年降水1 105.5 mm、日照1 276.7 h，氣候為亞熱帶季風氣候。供試土壤為中性紫色水稻土，由侏羅紀沙溪廟組紫色砂、頁巖的坡積物和殘積物母質發(fā)育而成的紫色土(類)、中性紫色土亞類、灰棕紫泥土屬經(jīng)水耕熟化過程而形成。

本研究涉及其中9個處理：①CK(無肥區(qū))；②N；③NP；④NK；⑤NPK；⑥M；⑦NPK+M；⑧1.5NPK+M；⑨(NPK)Cl+M。M代表豬糞尿，處理8為化肥增量區(qū)，氮、磷、鉀肥用量是其它各處理的1.5倍，處理9為含氯化肥試驗區(qū)，氮、鉀肥用氯化銨、氯化鉀；其它各處理氮、鉀肥分別用尿素、硫酸鉀；磷肥用過磷酸鈣。其中每種肥料的施用量為：氮肥150 kg·hm-2；磷肥60 kg·hm-2；鉀肥60 kg·hm-2；有機肥22.5 t·hm-2，其水分含量為89%，N、P、K養(yǎng)分干基含量分別為0.48%、0.26%和0.77%。試驗地采用小麥-水稻輪作，小區(qū)面積120 m2，小區(qū)之間用40 cm深的水泥板隔開，互不滲漏，且能獨立排灌。

1.2 樣品采集

于2016年10月水稻收割后進行田間取樣，用土鉆鉆取0～20 cm的耕作層土樣，混勻，挑去肉眼可見細根后過2 mm篩，放入-20℃的冰箱保存以備后續(xù)分析。部分放入冰箱于4℃保存，立即進行硝化細菌數(shù)量、氨氧化潛勢及硝化強度的測定，另取一部分放于室內(nèi)風干供基本理化分析用。供試土壤基本理化性質見表1。

表1 供試土壤的基本性質

1.3 測定項目及方法

土壤pH值用酸度計法[13]，有機碳用重鉻酸鉀容量法，全氮用半微量凱氏法，全磷用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法，全鉀用氫氧化鈉堿熔-火焰光度法，有效磷用Olsen法，速效鉀用醋酸銨浸提-火焰光度法[14]。

土壤氨氧化細菌和氨氧化古菌amoA基因的Real-time PCR分析：稱取0.5 g鮮土，用土壤Fast DNA?SPIN Kit(QBIO gene Inc.,Carlsbad,CA,USA)提取不同處理土壤微生物總DNA，提取過程按試劑盒說明書進行。用iQ5(Bio-rad,USA)熒光定量PCR儀，通過SYBR Green法來測定氨氧化細菌和氨氧化古菌amoA基因的豐度，amoA基因的擴增用SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKara Bio,Otsu,Shiga,Japan)，氨氧化細菌和氨氧化古菌的amoA基因擴增引物分別為amoA-1F/amoA-2R、Arch-amoAF/Arch-amoAR[15-17]，PCR擴增反應體系為25 μL，引物序列及反應程序參見表2。Real-time PCR反應完成后設置溶解曲線用以檢驗產(chǎn)物的特異性，其程序為 55～99℃之間，起始模板濃度由 Ct 值確定。數(shù)據(jù)分析采用 iCycler 軟件(version 1.0.1384.0 CR)。標準質?？截悢?shù)的對數(shù)值作為縱坐標，不同濃度質粒的 Ct值作為橫坐標，建立標準曲線[18]。

表2 PCR引物和反應程序

硝化細菌的測數(shù)采用稀釋頻度法(most probable numble method,MPN法)[19];氨氧化潛勢的測定參考Kurola等[20]的方法；硝化強度的測定采用懸液培養(yǎng)法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2003和SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，S-N-K 檢驗計算顯著性差異(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 不同施肥對紫色土硝化微生物的影響

2.1.1 不同施肥紫色土氨氧化細菌與氨氧化古菌豐度分析

Real-time PCR的結果如表3所示?？梢钥闯觯煌┓侍幚硗寥乐邪毖趸毦鷄moA基因拷貝數(shù)變化較大，每克干土拷貝數(shù)(4.46×103～5.41×105)的log值在3.65～5.73之間，單施化肥或化肥與有機肥配合施用均顯著提高該土壤氨氧化細菌豐度，1.5NPK+M處理最高，為CK處理的121倍，而單施有機肥處理土壤氨氧化細菌豐度與CK處理相比差異不顯著。施用磷肥處理(NP、NPK+M、1.5NPK+M)土壤氨氧化細菌豐度顯著高于未施磷處理(N、NK、M)，NPK處理也高于未施磷處理，說明磷素營養(yǎng)是影響氨氧化細菌生長重要的因素之一。(NPK)Cl+M處理土壤氨氧化細菌豐度對數(shù)值為5.41，顯著低于NPK+M和1.5NPK+M處理的5.62和5.73，可推測含氯化肥的施用會在一定程度上抑制氨氧化細菌生長。

表3 不同施肥處理對氨氧化細菌與氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)的影響(Log) (g-1干土)

注：不同小寫字母分別表示處理間差異達5%顯著水平。

依據(jù)標準曲線用Real-time PCR技術獲得的不同施肥處理氨氧化古菌aomA基因拷貝數(shù)變化較小，結果如表3所示。NP處理每克干土aomA基因拷貝數(shù)最高達1.38×107(Log值為7.14)，(NPK)Cl+M處理每克干土aomA基因拷貝數(shù)最低為1.64×106(Log值為6.21)，除施用NP顯著提高了土壤氨氧化古菌豐度外，其他施肥處理土壤氨氧化古菌aomA基因拷貝數(shù)差異不顯著，說明施肥對該土壤氨氧化古菌豐度的影響較小。

2.1.2 不同施肥紫色土硝化細菌數(shù)量的變化

由圖1可知，施肥影響了硝化細菌的數(shù)量。土壤硝化細菌數(shù)量變化幅度較大，呈0.39×102～7.28×103個·g-1干土變化。與CK相比，單施化肥或化肥與有機肥配合施用均顯著提高該土壤硝化細菌數(shù)量，以1.5NPK+M處理硝化細菌數(shù)量最高，達7.28×103個·g-1干土,NPK+M處理次之，為2.91×103個·g-1干土，NP、NK、NPK和N處理之間差異不顯著，但(NPK)Cl+M處理顯著低于以上施肥處理，M處理最低且與CK相比無顯著性差異。

圖1 不同施肥處理土壤硝化細菌數(shù)量的變化

2.2 不同施肥對紫色土硝化特征的影響

2.2.1 不同施肥紫色土氨氧化潛勢的變化

氨氧化(也稱亞硝化)作用是硝化作用的第一個過程，氨氧化潛勢也稱硝化速率，可以用來表征土壤氨氧化能力[20]。由圖2可以看出，施肥明顯影響了該土壤氨氧化潛勢變化，NPK+M處理土壤氨氧化潛勢最高，為0.310 μg·g-1·h-1干土，其次分別為NPK、NP、M處理，以上處理與CK處理的土壤氨氧化潛勢0.157 μg·g-1·h-1干土相比，均顯著提高了土壤氨氧化潛勢，提高量分別為97.5%、82.8%、67.5%、56.7%和41.8%。N和NK對土壤氨氧化潛勢無明顯影響，而(NPK)Cl+M顯著降低了土壤氨氧化潛勢，相較CK降低了81.5%。由此可見，施用磷肥處理土壤氨氧化能力相對較高，而含氯化肥的施用極大抑制了土壤氨氧化能力，不同施肥處理土壤氨氧化潛勢與土壤氨氧化細菌amoA基因拷貝數(shù)(表3)變化較一致。

2.2.2 不同施肥紫色土硝化強度的變化

亞硝酸氧化作用是硝化作用的第二個過程，亞硝酸氧化細菌將NH4+-N 氧化成NO3--N 的作用可以用硝化強度表示。由圖2可以看出，不同施肥制度對土壤硝化作用強度有明顯的影響，硝化強度的變幅在25%～59%之間。與土壤氨氧化潛勢變化類似，相較于CK處理的土壤硝化強度(32%)，除(NPK)Cl+M處理外，所有施肥處理土壤硝化強度均得到顯著提高。NPK+M處理硝化強度最高，為59%，1.5NPK+M 、M 、NPK、NP處理相接近，在43%～53%，N與NK處理無顯著差異，分別為38%和39%，(NPK)Cl+M顯著降低了土壤硝化強度，為25%。施肥對土壤硝化強度的影響與土壤硝化細菌的數(shù)量(圖1)變化不一致。

圖2 不同施肥處理土壤氨氧化潛勢與硝化強度的變化

3 討論

3.1 不同施肥對紫色土氨氧化菌amoA基因與硝化細菌數(shù)的影響

在本試驗條件下氨氧化古菌amoA基因拷貝數(shù)要遠遠高于氨氧化細菌，其比值范圍為6.37～657.72。在每克干土中高達1.38×108，這一結果與許多土壤環(huán)境研究中得到氨氧化古菌amoA基因高拷貝數(shù)相一致[22-23]，不過在農(nóng)田土壤中，雖然AOA在數(shù)量上占絕對優(yōu)勢，但氨氧化過程卻仍主要由AOB完成[24]。

研究結果表明，土壤AOB豐度受到了長期不同施肥管理措施的影響。施用氮肥顯著提高了土壤AOB豐度(表1)，這是由于氮肥為AOB提供了直接可利用的氮源[25]，在以往的研究中也得到類似的結果[10]。同時，值得注意的是施用磷肥處理土壤AOB均高于對應的不施磷肥處理，在他人研究中也發(fā)現(xiàn)AOB豐度與土壤速效磷呈正相關[26]，表明磷在一定意義上也促進了氮循環(huán)功能微生物的生長[27]。目前關于磷肥對土壤功能微生物的影響的研究較少，需要加強此類的研究。(NPK)Cl+M處理土壤AOB豐度顯著低于其他施肥處理，一方面這可能與含氯化肥的施用降低了土壤pH值(表1)有關，由于AOB適宜生長的酸度范圍為pH值7.0～8.5，一般在pH值小于6.5的環(huán)境中不易生長[28]，基于不同pH值的紫色土的研究也表明，酸性紫色土中AOB和AOA的豐度低于中性和石灰性紫色土[29]；另一方面可能是Cl-本身對AOB形成了毒害作用所致[30]。

結果還表明，相對于對AOB豐度的影響，長期不同定位施肥對AOA豐度的影響較小，這可能是本試驗研究采用的是中性紫色土，與其他研究中所采用的酸性土或者堿性土有所差別。因此，施肥對土壤氨氧化微生物豐度的影響非常復雜，可能與肥料的種類、施肥方式、土壤類型和利用方式等因素有關[12]。

施肥能顯著提高該土壤硝化細菌數(shù)量(圖1)。有機無機肥配施對比單施無機肥顯著增加了土壤硝化細菌數(shù)量，1.5NPK+M處理硝化細菌的數(shù)量最高，是由于長期向土壤中投入高量化肥和有機肥為硝化細菌提供了更多可利用的無機營養(yǎng)物質以及碳源所致[31]；而單施有機肥硝化細菌數(shù)量與長期無肥處理無顯著性差異，源于化能自養(yǎng)型硝化細菌是硝化反應的主要作用者，不利用有機碳化合物作為碳源和能源，有機質甚至可能會抑制硝化細菌生長[31]。(NPK)Cl+M處理硝化細菌數(shù)量相對較低，這可能與土壤pH值有關，一般認為土壤硝化細菌生長最適pH值范圍在8.5左右，該處理土壤pH值為5.6時對土壤硝化細菌的影響相對于為硝化細菌提供營養(yǎng)物質這一因素顯得更為突出。

3.2 不同施肥對紫色土氨氧化潛勢和硝化強度的影響

硝化作用是由土壤微生物主導的作物氮素營養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，施肥是調控土壤微生物硝化作用的手段[32]。同施肥對土壤氨氧化細菌豐度的影響類似，氮肥、磷肥均對土壤氨氧化潛勢有顯著的提高作用，有機無機肥配施顯著提高了土壤氨氧化潛勢，表明了農(nóng)田土壤中氨氧化過程仍由氨氧化細菌主導[24,33]。不同施肥處理土壤硝化強度的變化與氨氧化潛勢變化表現(xiàn)出相同的趨勢，表明了土壤硝化過程中氨氧化過程是主要的限速步驟[34]。但同時發(fā)現(xiàn)長期不同施肥下硝化細菌數(shù)與土壤氨氧化潛勢及土壤硝化強度變化并不一致，有研究認為硝化細菌數(shù)量與土壤硝化強度無顯著相關關系[35-36]，本試驗也證實了這一結果。另外，含氯化肥的施用導致其土壤氨氧化潛勢與硝化強度顯著低于其它處理，源于長期施用含氯化肥導致土壤酸化，而pH值影響著土壤NH3的存在形態(tài)，低pH值時氨分子會轉為NH4+，底物濃度的變化影響了氨氧化菌的豐度和多樣性[37]，結果表現(xiàn)為低pH值抑制了土壤硝化強度[38]。

4 結論

在水旱輪作體系下的中性紫色土上，相較于對土壤氨氧化古菌豐度的影響，長期施肥對土壤中氨氧化細菌豐度的影響較大，施用氮肥及施用磷肥都顯著提高了氨氧化細菌的豐度，單施有機肥對土壤氨氧化細菌豐度沒有顯著影響，而有機無機配施則可以顯著改善土壤氨氧化微生物豐度。值得注意的是長期施用含氯肥料顯著抑制了土壤氨氧化潛勢與硝化強度。長期不同施肥下氨氧化潛勢與硝化強度的變化較為一致，硝化強度與硝化細菌數(shù)量的變化不一致，因此不能用硝化細菌數(shù)量的多少表征紫色土的硝化強度。本研究表明，長期施肥，特別是有機無機肥配施能支持更大的土壤的氨氧化微生物群體，從而增加紫色土氨氧化潛勢與硝化強度，對研究中性紫色土的氮循環(huán)具有重要意義。