張志剛，司立英，趙智中，王榮花，王立華，李巧云，劉栓桃

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/國家蔬菜改良中心山東分中心/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250100; 2.聊城市東昌府區(qū)農(nóng)業(yè)局,山東 聊城 252000)

插入/缺失 (Insertion/Deletion，簡稱InDel) 標(biāo)記是基于全基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā)的針對基因組中核酸序列的插入或缺失而設(shè)計的PCR標(biāo)記，是一種共顯性標(biāo)記，具有較好的穩(wěn)定性和豐富的多態(tài)性[1-3]，適合全基因組已經(jīng)測序物種的種質(zhì)多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL定位、基因型鑒定、雜交種真實(shí)性以及純度鑒定等方面的研究。InDel標(biāo)記的檢測手段常根據(jù)插入/缺失序列的大小，而采用瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或熒光毛細(xì)管電泳[3-5]，鮮見采用高分辨率熔解曲線技術(shù)檢測InDel標(biāo)記的有關(guān)報道。

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting，HRM)分析技術(shù)是近年來發(fā)展的一種用于突變掃描和基因分型的分子遺傳學(xué)分析方法。其原理主要是根據(jù)DNA序列的長度、GC含量以及堿基互補(bǔ)性差異，致使任一雙鏈DNA分子在加熱變性時都有一個特定的熔解曲線性形狀。Ririe等[6]較早報道利用熒光染料對雙鏈 DNA 進(jìn)行熔解曲線分析的研究，自2000年以來，利用熒光標(biāo)記的探針大大提高了HRM檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，可以有效檢測PCR產(chǎn)物間單個堿基的差異[7]。近年來，隨著飽和熒光染料的開發(fā)和使用，HRM檢測可以不使用成本較高的探針，而是在常規(guī)PCR反應(yīng)體系中直接加入飽和熒光染料，PCR結(jié)束后在高分辨率曲線檢測設(shè)備上實(shí)現(xiàn)閉管直接分析，從而大大簡化試驗(yàn)流程、降低試驗(yàn)成本[8-10]。HRM技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)和動植物單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型方面得到非常廣泛的應(yīng)用[10-14]，然而其在InDels標(biāo)記檢測方面的應(yīng)用還比較少。趙均良等[15]應(yīng)用HRM技術(shù)檢測了一個水稻的SSR標(biāo)記，該標(biāo)記涉及四個堿基的差異，在非變性PAGE膠上難以區(qū)分，用HRM技術(shù)得到較好的分辨。蘇曉梅[16]利用HRM技術(shù)開發(fā)了一個番茄抗Ty1-InDel標(biāo)記，利用該標(biāo)記對83份番茄材料進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定，取得良好效果。劉源霞等[17]將基于重測序技術(shù)開發(fā)的10個抗蘋果炭疽病InDel標(biāo)記中的4個成功轉(zhuǎn)化成HRM標(biāo)記，并用于對分離群體的鑒定。關(guān)于大白菜InDel標(biāo)記的HRM分析技術(shù)尚未見報道。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，對已經(jīng)鑒定的593對InDel標(biāo)記[3]進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，以獲得利用HRM分析技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定檢測的InDel標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記對課題組創(chuàng)制的大白菜種質(zhì)和大白菜雜交種進(jìn)行鑒定，構(gòu)建基于HRM技術(shù)的大白菜InDel標(biāo)記的高通量檢測技術(shù)，為實(shí)現(xiàn)大白菜種質(zhì)和雜交種純度的高效和高通量鑒定提供標(biāo)記儲備和技術(shù)保障，也為InDel標(biāo)記的廣泛應(yīng)用提供新的途徑和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選擇前期已經(jīng)完成全基因組重測序的大白菜自交系He102與06-247[3]作為基于HRM技術(shù)的InDel標(biāo)記開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參材料。HRM高效檢測技術(shù)的構(gòu)建則隨機(jī)選擇本課題組自行創(chuàng)制的大白菜種質(zhì)90份和牛早秋1號雜交種，種子直播后于幼苗期取葉片備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 參照劉栓桃等[18]的方法，取大白菜幼嫩葉片組織約2 cm2置于2 mL螺口提取管中，加3粒直徑4 mm的陶瓷珠，再加800 μL TPS (100 mmol/L Tris-HCl，1 mol/L KCl，10 mmol/L EDTA，pH 8.0) 提取液，于自動研磨儀 (法國, Precellys24) 上5 000 r/min振蕩10 s，65℃恒溫箱保溫30～60 min，冷卻后4℃、12 000 r/min離心10 min；上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積氯仿顛倒混勻以去除雜蛋白，然后4℃、12 000 r/min 離心10 min；上清用等體積的異丙醇沉淀DNA，DNA沉淀用100 μL 10 mmol/L 的Tris-HCl (pH 8.0) 溶解后，用NanoDrop 2000分光光度計測定 DNA 濃度，并將工作液濃度稀釋到10 ng/μL并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 InDel標(biāo)記篩選 參照張志剛等[3]的研究結(jié)果，從593對已經(jīng)驗(yàn)證的InDel標(biāo)記中選擇，選擇標(biāo)準(zhǔn)參照劉栓桃等[4]的方法，即引物的擴(kuò)增結(jié)果在06-247與He102中特異性好、僅有單一目的條帶、無雜帶干擾。從BRAD[19]數(shù)據(jù)庫中下載大白菜參考基因組序列(Brapa_sequence_v1.5), 根據(jù)引物所在位置以及重測序結(jié)果獲得差異目標(biāo)片段序列，用軟件TMUtility_1.5預(yù)測序列的Tm值并計算每對引物擴(kuò)增的差異片段的Tm差值，如果差值絕對值大于0.2℃則將該對引物確定為潛在的適宜HRM分型的InDel標(biāo)記(潛在標(biāo)記)，用于后續(xù)的梯度PCR驗(yàn)證。

1.2.3 用于HRM分析的PCR擴(kuò)增體系 標(biāo)記的驗(yàn)證在梯度PCR儀 (Eppendorf Mastercycler?nexus gradient) 上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系包含10 μL，有如下成分：2×Taq PCR Mastermix [天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，KT201-12]5 μL、10 pmol/L 正/反向引物各1 μL、LC Green 飽和熒光染料(Idaho, BCHM-ASY-0005) 1 μL、滅菌雙蒸水2 μL，以25 μL石蠟油覆蓋。循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性120 s；94℃ 30 s，60～68℃ (沿96孔板從A—H橫向平均遞增約1.28℃) 30 s，72℃ 10 s，42次循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后25℃保存。PCR結(jié)束后在LightScanner-96(Idaho Technology Inc.)高分辨率熔解曲線分析儀上直接進(jìn)行分析。采用小片段擴(kuò)增法，用LightScanner Software Version 2.0 軟件進(jìn)行自動分型。

1.2.4 基于HRM技術(shù)的InDel標(biāo)記的高通量檢測體系及其應(yīng)用 由于LightScanner-96一次最多只能檢測96個樣品，為了適應(yīng)儀器的要求，降低檢測成本、提高檢測效率，在一塊96孔PCR板上只檢測一對引物，純系對照分別以He102與06-247為模板，雜合型對照以He102與06-247的DNA等量混勻物為模板，對照重復(fù)兩次以確保對照樣品被成功擴(kuò)增。本研究將A1、B1和A2、B2分別設(shè)置為He102與06-247兩個標(biāo)準(zhǔn)對照品，將H11和H12兩個孔設(shè)置為雜合型對照，其余90個孔是待檢測樣品。PCR反應(yīng)體系同上，退火溫度根據(jù)上述梯度PCR分析的結(jié)果確定，PCR結(jié)束后樣品的分析同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 InDel標(biāo)記的初步篩選

從已經(jīng)驗(yàn)證的593對InDel標(biāo)記中，通過PAGE膠擴(kuò)增條帶的識別，共篩選出特異性好、在06-247與He102中僅能擴(kuò)增出單一條帶、變異位于編碼區(qū)的標(biāo)記271對。對于這些篩選到的標(biāo)記，逐一預(yù)測目標(biāo)片段的Tm值以及Tm差值，其中有63對標(biāo)記，其包含差異位點(diǎn)片段的Tm差值絕對值大于0.2℃，這63對標(biāo)記的變異信息在10條染色體上的分布見表1。

表1 預(yù)測InDel標(biāo)記在大白菜基因組中的分布

2.2 適宜HRM分型的InDel標(biāo)記

由于飽和熒光染料的加入會改變引物的退火性質(zhì)，因此對每對中選引物先進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增，以確定最佳退火溫度。引物IDA01058的梯度PCR擴(kuò)增結(jié)果分型報告如圖1所示。報告主體由四部分組成，如圖1 A—D。其中圖1A是分析參數(shù)的簡要概括，有熔解曲線分析溫度設(shè)置的起止范圍(melt temperature range)、熒光信號捕獲的曝光時間(exposure)、基因分型(amplicon genotyping analysis parameter)參數(shù)，主要包括選擇的溫度范圍(temperature range )、靈敏度(sensitivity)的設(shè)置(默認(rèn)是normal，即常規(guī))、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(standards)的選擇(本試驗(yàn)以06-247與He102兩種材料在65.2℃即E5和E6的擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線為兩種標(biāo)準(zhǔn)基因型對照，即圖中的Use Internal Standards)。

圖1B表示本報告分析的樣品在96孔PCR板上的直觀排列，白色是剔除的樣品，第5列 (以He102為模板)和第6列(以06-247為模板)是本報告分析的樣品，E5(以He102為模板的擴(kuò)增子熔解曲線指定為AA，系統(tǒng)以紅色表示)和E6(以06-247為模板的擴(kuò)增子熔解曲線指定為BB，系統(tǒng)以灰色表示)是設(shè)定的內(nèi)標(biāo)基因型，軟件運(yùn)行分型后，會自動按照給定的基因型標(biāo)準(zhǔn)給出分型結(jié)果，并按相應(yīng)的顏色展示出來。如圖1B所示，凡是與E5熔解曲線相同的基因型，以紅色體現(xiàn)，而凡是與E6熔解曲線相同的基因型以灰色體現(xiàn)。與兩者都不匹配的，顯示未知并以綠色體現(xiàn)。

圖1C和圖1D分別是各樣品的熔解曲線形式和對應(yīng)的峰值轉(zhuǎn)化圖，線條顏色與圖1B相對應(yīng)。從分型結(jié)果可以看出，He102的擴(kuò)增子在不同的退火溫度下擴(kuò)增效率有顯著區(qū)別，雖然高于63.9℃的5個孔(D5—H5)的樣品都成功分型為一類，但從熔解曲線的形式直觀看，只有4個孔(E5—H5)的曲線高度擬合，其退火溫度在65.2℃及以上。而以06-247為模板的擴(kuò)增子其擴(kuò)增效率受退火溫度的影響較小，所有孔的樣品熔解曲線均高度擬合。綜合兩者的擴(kuò)增結(jié)果，引物IDA01058的最佳退火溫度應(yīng)在65.2～68.0℃之間。采用相同的方法分析其它62對引物，最終從中篩選到20對適合用高分辨率熔解曲線進(jìn)行分析的引物，其退火溫度基本是在最初設(shè)計的退火溫度基礎(chǔ)上加5℃。

A:分型報告運(yùn)行參數(shù)；B：分型報告的樣品在96孔板上的排列及其基因型鑒定結(jié)果；C：分析樣品的熔解曲線圖；D：分析樣品的熔解曲線峰值轉(zhuǎn)換圖。下圖同。

2.3 基于HRM技術(shù)的大白菜InDel標(biāo)記高通量檢測體系及應(yīng)用

采用鑒定的InDel標(biāo)記IDA01061的正反向引物，在96孔PCR板上對90份種質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果的自動分型報告如圖2所示。與圖1的結(jié)構(gòu)相同，圖2A顯示了自動分型的基本參數(shù)，圖2B是分型結(jié)果在96孔板上的直觀體現(xiàn)，從中可以看出，3個標(biāo)準(zhǔn)樣品即純合基因型AA(A1、B1)、BB(A2、B2)以及雜合基因型AB (H11、H12)的擴(kuò)增結(jié)果重復(fù)性非常好，這表明反應(yīng)體系和反應(yīng)條件非常適宜。其余90份待檢樣品全部得到精準(zhǔn)鑒定，結(jié)果直觀展示在96孔板上。其中8份種質(zhì)是純合AA基因型，72份種質(zhì)是純合BB基因型，10份種質(zhì)在該位點(diǎn)為雜合型。相應(yīng)結(jié)果可以通過軟件導(dǎo)出為Excel表格，從而實(shí)現(xiàn)自動分型。圖2C和2D分別是均一化處理后的熔解曲線圖和熔解曲線峰值轉(zhuǎn)換圖。

采用標(biāo)記IDA10055對牛早秋1號的雜交種純度進(jìn)行鑒定，采用同樣的96孔板布局，鑒定結(jié)果的熔解曲線如圖3所示。在鑒定的90株幼苗中，雜合型AB有85株，雜合率94.4%，其余5株都是BB(母本)基因型，未檢出AA(父本)基因型。

圖2 基于HRM技術(shù)的InDel標(biāo)記對大白菜種質(zhì)的鑒定報告

AA、AB、BB指不同基因型。

圖3基于HRM技術(shù)的InDel標(biāo)記對牛早秋1號>雜交種純度鑒定的熔解曲線

3 討論與結(jié)論

高分辨率熔解曲線(high-resolution melting, HRM)分析技術(shù)是基于核酸小片段之間的GC含量差異而導(dǎo)致雙鏈核酸解鏈溫度差異的一門檢測技術(shù)。該技術(shù)具有三大優(yōu)勢：一是操作簡單、快捷、節(jié)省時間成本；二是高通量、高靈敏度、高特異性、低成本且不受檢測位點(diǎn)的限制；三是閉管操作、無污染且DNA不受損傷，熔解分析后還可以進(jìn)行凝膠電泳或測序分析[20]。HRM技術(shù)在大白菜突變體篩查方面的研究已有報道。劉夢洋等[21]采用HRM分析技術(shù)鑒定大白菜EMS誘變的突變體，篩選到單堿基突變材料，而有關(guān)利用HRM技術(shù)檢測插入/缺失突變及其在大白菜種質(zhì)篩查和雜交種純度鑒定方面的應(yīng)用尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，HRM技術(shù)所需儀器LightScanner具有快速靈敏的特性，為保證熔解曲線平滑無雜峰，就要求PCR產(chǎn)物最好只有單一擴(kuò)增產(chǎn)物。這一點(diǎn)我們在篩選標(biāo)記時作了充分考慮，只選擇那些前期鑒定為單一擴(kuò)增條帶的引物[3]，作為適宜HRM技術(shù)檢測的備選標(biāo)記。另外，為了提高轉(zhuǎn)化的成功率，用特定的軟件對目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解溫度進(jìn)行預(yù)測，從271對特異性好的標(biāo)記中篩選到63對適宜進(jìn)行HRM分析的標(biāo)記，最終用PCR方法擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)材料，獲得了20對適宜用HRM技術(shù)分析的InDel標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成功率高達(dá)31.7%。梯度PCR的結(jié)果證實(shí)，加入飽和熒光染料后，引物的退火溫度普遍比預(yù)測的退火溫度升高5℃，這為后續(xù)應(yīng)用HRM技術(shù)轉(zhuǎn)化其它標(biāo)記提供了借鑒。

在構(gòu)建基于HRM技術(shù)的高通量InDel標(biāo)記檢測體系時，為了提高分析的準(zhǔn)確率，同時簡化分析流程、降低試驗(yàn)成本，本研究在每塊96孔PCR板上都設(shè)置兩種純合基因型對照以及兩種純合基因型模板等量混合后的雜合基因型對照，每個對照重復(fù)兩次，以確保對照樣品被成功擴(kuò)增而獲得對照樣品的熔解曲線作為內(nèi)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)基因型對照，這樣便于用軟件對供試材料進(jìn)行自動分型。本研究將開發(fā)的基于HRM技術(shù)的InDel標(biāo)記用于大白菜種質(zhì)鑒定和雜交種純度鑒定，取得良好分析效果。

無論是SNP標(biāo)記還是InDel標(biāo)記，一旦建立其HRM檢測技術(shù)，該標(biāo)記便可用于分子標(biāo)記應(yīng)用的各個方面，諸如遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析、分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)精準(zhǔn)鑒定、種質(zhì)DNA指紋圖譜構(gòu)建、雜交種純度和真實(shí)性鑒定等。本研究開發(fā)的20對基于HRM檢測技術(shù)的InDels標(biāo)記可作為標(biāo)記儲備用于上述分子標(biāo)記鑒定方面。由于InDel標(biāo)記在基因組中呈共顯性存在，且大多數(shù)位點(diǎn)只有兩種基因型[4]，因此非常適合高通量檢測和鑒定等方面的應(yīng)用，其應(yīng)用范圍和前景非常廣闊。