王澤永

摘 要：目的：對(duì)祁山藥中的多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，確定最佳提取工藝（料液比、提取溫度、提取時(shí)間、丙酮體積分?jǐn)?shù)），并對(duì)提取液中的祁山藥多酚用Folin_Ciocalteu（福林酚）試劑比色法進(jìn)行含量測定。方法：通過單因素試驗(yàn)法（料液比、丙酮的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和溫度的變化）來確定提取祁山藥中多酚時(shí)每個(gè)因素的最佳提取條件，再用正交試驗(yàn)法來確定提取山藥中多酚時(shí)的提取條件的最優(yōu)組合。結(jié)果：祁山藥多酚的最優(yōu)提取工藝：提取溶劑用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮，料液比1∶20，提取時(shí)間80min，提取溫度55℃。結(jié)論：試驗(yàn)方法簡便、操作簡單、準(zhǔn)確度高，能夠用來測定祁山藥以及其他所含多酚類物質(zhì)的植物中的多酚含量，并且還能為山藥多酚的深入研究和綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：祁山藥；多酚；提?。籉olin_Ciocalteu試劑比色法；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) TQ464 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）14-0013-04

The Extraction and Determination of Polyphenol in Chinese Dioscorea opposita Thunb.

Wang Zeyong

（Agricultural College of Hebei Agricultural University，Baoding 071000，China）

Abstract：Objective：In order to extract the polyphenols in Chinese Dioscorea opposita Thunb，and determine the optimal extraction process （liquid ratio，extraction temperature，extraction time，and acetone volume fraction）. The content of polyphenols in the extracted liquid was measured by Folin_Ciocalteu（forinol） reagent colorimetry. Method：The optimal extraction conditions of polyphenols from Chinese Dioscorea opposita Thunb were determined by single factor test （ratio of liquid to material，volume fraction of acetone，extraction time and temperature change）. Orthogonal test was used to determine the optimal combination of extraction conditions for polyphenol extraction from Chinese Dioscorea opposita Thunb. Result：The optimum extraction process of polyphenols from Chinese Dioscorea opposita Thunb was determined by this experiment. The liquid to liquid ratio is 1∶20. The extraction time is 80 minutes；Extraction temperature was 55℃. Conclusion： The test method is simple，the operation is simple，high accuracy，can be used to determination of yam and other polyphenols contained polyphenols content in plants，and also for the further research of Chinese Dioscorea opposita Thunb polyphenols and provide theoretical basis for comprehensive development and utilization.

Key words：Dioscorea opposita Thunb；polyphenols；extract；Folin_Ciocalteu reagent colorimetry；Orthogonal test

祁山藥，為產(chǎn)自河北安國的山藥統(tǒng)稱，品種有“小白嘴、棒藥、紫藥”，是八大祁藥之一，為薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷的干燥塊莖。祁山藥多分布在我國華北、西北及長江流域的江西、湖南等地[1]，其性平、味甘，具有健脾、固腎和益肺等功效，是我國傳統(tǒng)的藥食同源類植物，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。明代醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍在《本草綱目》中將山藥的功效總結(jié)為“益腎氣，健脾胃，止泄痢，化痰涎，潤皮毛”5個(gè)方面[2]。這與山藥中所含有的多酚類化合物這一抗氧化活性物質(zhì)有一定的關(guān)系，它具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫等功能[3]。目前，有關(guān)山藥多酚的研究，無論是國內(nèi)還是國外都比較少，主要集中在對(duì)山藥多糖的研究[4-5]。本試驗(yàn)以祁山藥為試驗(yàn)對(duì)象，用丙酮作為提取溶劑，探索山藥多酚的最佳提取條件，以期為山藥的深入研究及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 祁山藥為在安國藥材市場所買的山藥品種“小白嘴”。

1.1.2 主要試劑 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司；丙酮、無水碳酸鈉，均為國產(chǎn)分析純；Folin_Ciocalteu（福林酚）試劑。

1.1.3 主要儀器 TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)，賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；儀表恒溫水浴鍋，上海樹立儀器儀表有限公司；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京陸?？萍加邢薰?；四兩裝高速萬能粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；UH5300紫外分光光度計(jì)，天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；比色皿、容量瓶（10、50mL）、燒杯、離心管、電子分析天平等。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料處理 首先稱取一定量的祁山藥，將山藥用水沖洗，除去附著在表面的泥沙，然后用小刀輕輕將皮去掉，切成厚薄大致均勻的薄片狀，將其放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中45℃烘干至恒重，再用高速萬能粉碎機(jī)粉碎后放入干燥器中備用。

1.2.2 山藥多酚的提取 在備用的干燥器中準(zhǔn)確稱取3g祁山藥粉末，在設(shè)定的各種條件下提取多酚，然后用濾紙過濾掉所剩殘?jiān)?，把濾液放置于離心管中，在放于低速離心機(jī)中離心，設(shè)定離心條件為轉(zhuǎn)速為4000r/min，等待10min，取出離心管，用移液管準(zhǔn)確稱量一定量的上清液與50mL容量瓶中，并加入蒸餾水定容至刻度。

1.3 單因素試驗(yàn)法

1.3.1 丙酮體積分?jǐn)?shù) 用天平準(zhǔn)確稱取3g祁山藥粉末，然后放置于帶有不同標(biāo)記的燒杯中，固定料液比為1：20（m/v），在55℃的恒溫水浴鍋中，用體積分?jǐn)?shù)為40%的丙酮溶液提取100min，然后再用不同體積分?jǐn)?shù)（50%、60%、70%、80%）的丙酮溶液提取，以上清液中的多酚含量為指標(biāo)，分析提取山藥多酚時(shí)所需最適丙酮體積分?jǐn)?shù)，確定最佳提取工藝。

1.3.2 料液比 用天平準(zhǔn)確稱取3g祁山藥粉末，然后放置于帶有不同標(biāo)記的燒杯中，選用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮作為提取溶劑，選取的料液比分別是1∶15、1∶17.5、

1∶20、1∶22.5、1∶25，在55℃恒溫水浴鍋加熱提取100min，以山藥提取液中提取出來的上清液中的多酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析提取山藥多酚時(shí)所需的最適料液比，確定最適提取山藥多酚的條件。

1.3.3 提取溫度 用天平準(zhǔn)確稱取3g山藥粉末置于帶有不同標(biāo)記的燒杯中，固定料液比為1∶20，在恒溫水浴鍋中用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶液提取，水浴溫度從35℃到75℃變化，每升高10℃提取1次，每次用水浴加熱提取100min，以山藥提取液中提取出來的上清液中的多酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析提取山藥多酚時(shí)所需的最適提取溫度，確定最佳提取工藝。

1.3.4 提取時(shí)間 用天平準(zhǔn)確稱取3g山藥粉末置于帶有1-5號(hào)標(biāo)記的燒杯中，固定料液比為1∶20，在溫度為55℃的恒溫水浴鍋中提取，提取溶劑用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶液，1號(hào)燒杯提取40min，2號(hào)燒杯提取60min，依次增加20min，直到5號(hào)燒杯提取120min，然后依次取出靜置，以山藥提取液中提取出來的上清液中的多酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析提取山藥多酚時(shí)所需的最適提取時(shí)間，確定最佳提取工藝。

1.4 正交試驗(yàn)法 正確分析每個(gè)單因素對(duì)提取山藥多酚的影響后，用正交試驗(yàn)法優(yōu)選出提取山藥多酚的最佳提取條件，在上述影響提取多酚的單因素選擇3個(gè)（料液比、時(shí)間和溫度），每個(gè)影響因素分別設(shè)置3個(gè)水平，按照L9（33）正交表的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1所示，將提取液置于離心管中離心，取一定量上清液，定容于50mL容量瓶中，用以測定山藥中的多酚含量。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 首先精確稱取5.000mg干燥的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，加入蒸餾水使其溶解，然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，用蒸餾水潤洗2遍燒杯，將潤洗后的溶液都轉(zhuǎn)移至容量瓶中，再加入蒸餾水定容至刻度，就可以配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5.2 繪制沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線 首先用移液管準(zhǔn)確稱取質(zhì)量濃度為100mg8L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，然后再分別置于規(guī)格為10mL的容量瓶中，并作上數(shù)字標(biāo)記，在每個(gè)容量瓶中分別加入Folin_Ciocalteu試劑2.0mL，然后再分別加入由無水碳酸鈉配制而成的10%的碳酸鈉溶液2.0mL，搖勻靜置后，再往容量瓶中加入蒸餾水至刻度下面，再用膠頭滴管定容至刻度，然后再在30℃的恒溫水浴鍋中加熱反應(yīng)1h后，在設(shè)定波長為765nm的條件下，用UH5300紫外分光光度計(jì)測定提取液的吸光度值，并且作試劑空白對(duì)照。以沒食子酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對(duì)原始數(shù)據(jù)的處理分析，并采用二元線性回歸法得到1個(gè)線性回歸方程為：

y=0.1613x+0.0343，r=0.9996

試驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸的質(zhì)量濃度在0～8mg/L的范圍內(nèi)與其吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

1.5.3 多酚含量的測定 用移液管精確吸取山藥多酚提取液2.0mL、Folin_Ciocalteu試劑2.0mL、10%碳酸鈉4.0mL于10mL容量瓶中，充分震蕩、搖勻，再加蒸餾水定容至刻度后，于30℃的恒溫水浴鍋中加熱反應(yīng)1h，在設(shè)定波長為765nm的條件下，用UH5300紫外分光光度計(jì)測定多酚提取液的吸光度值，并且再用只加試劑不加樣品的對(duì)照組作空白對(duì)照，記錄下測得的吸光度值，然后將得到的數(shù)值代入上述由標(biāo)準(zhǔn)品測得的線性回歸方程中去，通過計(jì)算得出山藥提取液中的多酚含量，以此來確定山藥最佳提取的條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 山藥提取液中的多酚含量受丙酮體積分?jǐn)?shù)的影響 由圖1可知，多酚含量呈先上升，后下降的趨勢(shì)，表示丙酮的體積分?jǐn)?shù)不斷增大（40%～80%），在山藥中提取出來的多酚含量也隨之變化，即先增多后減少，并且當(dāng)用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮溶液提取山藥中的多酚時(shí)，此時(shí)測得的提取液中的吸光度值為最高，即多酚含量達(dá)到最大，所以，提取溶劑用50%的丙酮提取最佳。

2.1.2 山藥提取液中的多酚含量受料液比的影響 由圖2可知，隨著料液比的不斷增大，山藥提取液中的多酚含量逐漸上升，當(dāng)上升到一定值時(shí)趨于平緩，所用的料液比為1∶22.5時(shí)，山藥提取液中的多酚含量在此實(shí)驗(yàn)中最高，但與料液比為1∶20時(shí)的數(shù)值幾乎并無差別，折線幾乎趨于平緩，綜合各種因素考慮，提取山藥中多酚時(shí)，所采用的最佳料液比為1∶20。

2.1.3 山藥提取液中的多酚含量受提取溫度的影響 由圖3可知，多酚含量呈上升下降又升高趨勢(shì)，表示用35～55℃的溫度提取山藥中的多酚時(shí)，提取出來的多酚是越來越多，在55℃時(shí)達(dá)到最高，然后再增加溫度提取出的多酚逐漸減少，雖然最后有所上升，但都遠(yuǎn)少于在55℃時(shí)所提取的含量值，所以55℃為最適溫度。

2.1.4 山藥提取液中的多酚含量受提取時(shí)間的影響 由圖4可知，多酚含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，表示在恒溫水浴鍋中提取多酚時(shí)，提取時(shí)間在80min之前，時(shí)間越多，提取的多酚越多，之后含量逐漸減少。因此，山藥中的多酚最佳提取時(shí)間為80min。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果的分析 根據(jù)正交試驗(yàn)表1進(jìn)行的試驗(yàn)，得出的數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2所示，通過觀察表2中的R值可知，B因素即提取溫度對(duì)從山藥中提取出來的多酚含量影響最大，C因素即提取時(shí)間的影響較溫度的影響小，而A因素即料液比對(duì)山藥中多酚的提取的影響最小。且通過觀察R值可知，A、B、C 3個(gè)因素中的最佳水平即最適提取條件為A2B3C1，即料液比為1∶20，提取溫度為55℃，提取時(shí)間為80min。

3 結(jié)論與討論

多酚是分子中具有多個(gè)羥基酚類成分的總稱，是廣泛存在于植物體內(nèi)的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]，具有抗氧化、抗衰老、健脾益肺等藥理功效。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)法優(yōu)選出來的最佳提取組合為：提取溶劑用體積分?jǐn)?shù)為50%的丙酮，料液比1∶20，提取時(shí)間80min，提取溫度55℃，在此條件下提取出來的多酚最多。

測定山藥中多酚含量的方法有多種，除了本試驗(yàn)所用的福林酚試劑比色法以外，還有普魯士藍(lán)（PB）法測定多酚含量[8]。但用普魯士藍(lán)法測定時(shí)，測得的多酚含量值不穩(wěn)定，誤差較用福林酚試劑法大，而用福林酚法測定時(shí)，不僅穩(wěn)定時(shí)間長，而且簡單易行，準(zhǔn)確度高。另外，提取溶劑的選擇也有多種，除丙酮-水溶劑可以有效提取多酚以外，還可以用乙醇來提取，多酚不僅易溶于乙醇，而且乙醇的沸點(diǎn)低，易回收，且不與其他試劑反應(yīng)，可以按照本試驗(yàn)的方法來確定用乙醇作為提取溶劑時(shí)的最佳體積分?jǐn)?shù)。

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