劉紫英，黃 磊，袁 斌，劉小林，*，徐勝光，黃 濤

(1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000； 2.宜春第九中學(xué)，江西 宜春 336000； 3.宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000； 4.昆明學(xué)院 云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214)

當(dāng)前制約我國草莓規(guī)模化生產(chǎn)的主要原因之一依然為連作障礙[1]，而連作障礙的主要原因是草莓自毒作用。草莓自毒引起土壤養(yǎng)分失衡和土壤微生物區(qū)系失調(diào)，同時(shí)根系分泌物中積累了大量有毒物質(zhì)[2]，因此研究根系自毒物質(zhì)對栽培作物產(chǎn)量的影響是當(dāng)今研究的有效途徑[3]。草莓根系分泌物中有一些化感物質(zhì)具有自毒作用[4]，而苯甲酸在化感物質(zhì)中含量很高，毒性較強(qiáng)[5]。草莓根系自毒物質(zhì)的加速降解或活性降低，會有助于控制草莓連作障礙的發(fā)生，篩選和開發(fā)微生物修復(fù)劑是解決作物連作障礙的熱點(diǎn)[6]。有研究表明，Erwineaherbicola[7]、Microbacteriumhydrocarbonoxydans[8]、Eubacteriumoxidoreducens[9]、Ochrobactrumsp.[10]等菌株可有效降解細(xì)菌。本研究篩選苯甲酸高效降解菌株，同時(shí)檢測其與草莓根腐病原的拮抗性，篩選到解毒抗菌雙重功能的菌株；探討利用細(xì)菌降解草莓自毒物質(zhì)的可行性，為草莓連作障礙的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓的品種為威州草莓。

供篩選降解菌株的土樣：于2016年11月28日取自江西省宜春市袁州區(qū)宜春學(xué)院正大門前方兩個草莓種植大棚，其中連作10年和3年的草莓種植大棚均采取五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取3個樣品，各取15份10～15 cm土樣。

F403尖孢鐮刀菌Fusarium.oxysporum(序列號MG515306)、F405腐皮鐮孢Fusariumsolani(序列號MG515307)、F407黃色鐮孢Fusariumculmorum(序列號MG515308)均為草莓根腐病病原，系宜春學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

供試苯甲酸分析純(天津永大化學(xué)試劑有限公司出產(chǎn))。Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、2×EasyTaqPCR SuperMix、Marker 2000 ladder、16S rDNA擴(kuò)增引物(27F: 5′-ATTCCGGTTGATCCTGC-3′，1541R: 5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)均購自生工生物工程有限公司。

PH100-DB00U-IPL數(shù)碼顯微鏡，江西鳳凰光學(xué)集團(tuán)有限公司；TGL-16G臺式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；752N紫外可見光分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；T100梯度PCR儀，Bio-Rad。

1.3 培養(yǎng)基

改良無機(jī)鹽培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量為蒸餾水；pH為7.2。

1.4 降解菌株的富集和分離

采用富集培養(yǎng)的馴化方法，將連作10年草莓種植大棚地(L1、L2、L3、L4、L5)和連作3年草莓種植大棚地(R1、R2、R3、R4、R5)隨機(jī)取樣10 g后接種入苯甲酸作為唯一碳源的基礎(chǔ)無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中。濃度梯度：L1和R1為100 mg·L-1、L2和R2為200 mg·L-1、L3和R3為300 mg·L-1、L4和R4為400 mg·L-1、L5和R5為500 mg·L-1，兩個對照組不接入土樣。在前期進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選后，設(shè)定140 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，然后將平板涂布于固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿于37 ℃培養(yǎng)72 h，然后挑取單個菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.5 降解菌株的篩選與鑒定

1.5.1 初篩

平板涂布之后，觀察固體培養(yǎng)基菌落生長情況，將長勢較好的固體培養(yǎng)基菌落進(jìn)行單菌落挑選實(shí)驗(yàn)，每株菌重復(fù)3次，將篩選純化培養(yǎng)得到的菌株分別進(jìn)行編號(L101、L102、……L501、L502、L503；R101、R102、R103……R501、R502、R503)。

1.5.2 復(fù)篩

將初篩獲得的降解菌株移接到三角瓶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含(NH4)2SO42 g·L-1，Na2HPO41.3 g·L-1，KH2PO42 g·L-1，苯甲酸 100～2 000 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，余量為蒸餾水；其苯甲酸濃度為1 000 mg·L-1，接種初篩降解菌(1×107cfu·mL-1，加上菌液濃度)量為每瓶1 mL，對照為1 mL無菌水，設(shè)定140 r·min-1、37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)7 d，觀察其生長情況，檢測苯甲酸殘留量。

1.6 降解菌菌株對苯甲酸的降解測定

1.6.1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

取苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)液0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL，分別加入到100 mL容量瓶中，加少量蒸餾水搖勻，然后用蒸餾水定容，以零管作參照對比，用石英比色杯在波長230 nm下分別測定其吸光度(D230)，以吸光度(D230)為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.2 樣品中苯甲酸殘留量的測定

在液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)7 d的過程中，期間每隔24 h，取出5 mL培養(yǎng)液加入到10 mL無菌離心管中，8 000 r·min-1，25 ℃，離心8 min后過濾(0.22 μm)，去掉菌體即為待測液。選用紫外可見分光光度法，用石英比色杯裝待測液在波長230 nm下測定其吸光度(D230)，根據(jù)吸光度(D230)和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中苯甲酸的殘留含量。

1.7 降解菌對草莓根腐病的皿內(nèi)拮抗作用

將復(fù)篩獲得效果最好的降解菌在LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)140 r·min-1，48 h后以10 000 r·min-1速度離心5 min，0.2 μm濾膜過濾得上清液備用。

F403尖孢鐮刀菌 (Fusariumoxysporum)、F405腐皮鐮孢(Fusariumsolani)、和F407黃色鐮孢(Fusariumculmorum)接種于PDA斜面，28 ℃培養(yǎng)5 d，加入無菌水，刮下孢子混勻成孢子懸浮液(1×107mL-1)。將懸浮液加入100 mL融化冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后制成含根腐病原菌的PDA平板。

凝固后在含病原菌PDA平板中間用無菌打孔器打孔，并取已過濾的降解菌L501 100 μL，28 ℃培養(yǎng)5 d，十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.8 降解菌的鑒定

對最佳降解菌株L501進(jìn)行形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色的微觀形態(tài)觀察，并測定其16S rDNA序列，選用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由生工生物工程公司進(jìn)行測序分析。將測序結(jié)果提交NCBI網(wǎng)站的GenBank，采用BLAST比對，并用MEGA6.0軟件構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，NJ算法，自展次數(shù)設(shè)定為1 000；結(jié)合《常見細(xì)菌鑒定手冊》鑒定菌株L501[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選及對苯甲酸的降解率

由苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得吸光度與苯甲酸濃度關(guān)系為：y=0.005x+0.006，R2=0.999(圖1)。由表1可以看出，分離純化出的67株菌株中有9株對苯甲酸均具有降解能力，分別為L203、L302、L403、L501、L502、R401、R402、R403、R503，其降解率在168 h時(shí)分別為13.3%、17.1%、43.2%、87.5%、40.8%、49.5%、46.1%、57.3%、42.7%，其中L501最高，為87.5%。

經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，9株降解菌對苯甲酸的降解率為13.3%～87.5%，說明從草莓根部土壤分離篩選出的菌株對苯甲酸具備有效降解能力。復(fù)篩結(jié)果表明，L501降解苯甲酸的能力最強(qiáng)，因而以L501做拮抗實(shí)驗(yàn)和鑒定。

2.2 降解菌對草莓根腐病的皿內(nèi)拮抗作用

降解菌株L501的發(fā)酵液表現(xiàn)拮抗活性，結(jié)果如表2。其中，對F405腐皮鐮孢Fusariumsolani菌株的生長具有很強(qiáng)的抑制作用，拮抗圈直徑達(dá)15.0 mm，對F403尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum拮抗直徑為14.5 mm；降解菌株L501對草莓根腐病菌F407黃色鐮孢Fusariumculmorum拮抗直徑為11.0 mm；且透明度都很好。綜上，降解菌株L501對草莓根腐病有較好的抑制作用。

2.3 降解菌株L501的鑒定

L501在168 h時(shí)對苯甲酸的降解率達(dá)到最高，降解率為87.5%。形態(tài)學(xué)觀察表明，降解菌菌落為乳白色，近圓形，邊緣光滑濕潤，稍具小齒，齒，表面皺褶，中部隆起。光學(xué)顯微鏡下可以觀察到菌株為革蘭氏陽性菌，為短桿菌；芽孢中生，稍膨大(圖2)。

圖1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of benzoic acid

表1九株降解細(xì)菌對苯甲酸降解率及苯甲酸的殘留量

Table1Degradation rate of benzoic acid by 9 strains of degrading bacteria and residual benzoic acid

降解菌編號Number指標(biāo)Score降解時(shí)間Degrading time/h24487296120144168L501殘留量Residual content/(mg·L-1)375.9256.0247.0206.5170.5118.062.5降解率Degrading rate/%24.848.850.658.765.976.487.5L502殘留量Residual content/(mg·L-1)382.1315.9298.6295.8237.5207.9160.9降解率Degrading rate/%23.636.840.340.852.558.467.8R403殘留量Residual content/(mg·L-1)287.6265.3190.7183.6179.3175.2170.8降解率Degrading rate/%28.133.752.354.155.256.257.3R401殘留量Residual content/(mg·L-1)267.4249.8208.3205.7203.6202.6201.9降解率Degrading rate/%33.237.647.948.649.149.449.5R402殘留量Residual content/(mg·L-1)281.9256.3219.5218.9217.3216.8215.6降解率Degrading rate/%29.535.945.145.345.745.846.1L403殘留量Residual content/(mg·L-1)297.2261.8235.1230.6228.3227.6227.3降解率Degrading rate/%25.734.641.242.442.943.143.2R503殘留量Residual content/(mg·L-1)388.7357.1303.8297.5294.1287.9286.7降解率Degrading rate/%22.328.639.240.541.242.442.7L302殘留量Residual content/(mg·L-1)268.1256.3253.9251.7250.1249.4248.7降解率Degrading rate/%10.614.715.416.116.616.917.1L203殘留量Residual content/(mg·L-1)186.2181.6179.5177.3176.5174.8173.4降解率Degrading rate/%6.99.210.311.411.812.613.3

表2L501對3種草莓根腐病病原菌的拮抗圈直徑

Table2Diameters of the inhibitory zones of strain L501 against three strawberry root rot

降解菌Degrading bacteria草莓根腐病病原菌Pathogenic fungi of strawberry root rot拮抗圈直徑Diameters of the inhibitory zones/mm透明度TransparencyL501L501L501F405 Fusarium solaniF403 Fusarium oxysporumF407 Fusarium culmorum15.014.511.0+++++++++

分子鑒定菌株L501的16S rDNA序列長度為1 456 bp，提交GenBank，獲得序列號為MG519283，用NCBI網(wǎng)站中BLAST程序進(jìn)行L501的序列與其相似性極高的序列比較分析，與降解菌L501的16S rDNA序列同源性在99%以上的菌株均為Bacillussubtilis，初步將此菌株歸為芽孢桿菌屬，選GenBank中與L501菌株相似性較高的5個菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。綜上，依據(jù)16S rDNA序列相似性分析，結(jié)合菌株L501形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，對照《常見細(xì)菌鑒定手冊》，鑒定菌株L501為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis。

圖2 菌株L501顯微特征(1 000×)Fig.2 Morphological characters of the strain L501(1 000×)

3 結(jié)論與討論

研究表明，對草莓連作自毒作用的降解菌多為放線菌，如解靈軍等[12]報(bào)道的對羥基苯甲酸降解菌菌株B3512和毛寧等[13]報(bào)道的淡紫褐鏈霉菌、Streptomycessp.。研究顯示，降解菌制成的放線菌制劑能有效減輕草莓連作的自毒作用。孫敬祖等[14]研究表明，放線菌可以定殖在草莓根表，并在草莓連作障礙修復(fù)中起到防病促生作用。

圖3 菌株L501的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the stain L501 based on 16S rDNA sequence

關(guān)于細(xì)菌對作物連作自毒作用的降解作用研究也有些報(bào)道。方艷芬等[15]研究表明，對苯甲酸的降解效果較好的細(xì)菌有假單胞菌、不動桿菌及產(chǎn)堿桿菌屬。而細(xì)菌作為草莓連作自毒作用的降解菌卻鮮見報(bào)道。何志剛等[16-17]通過研究表明，枯草芽孢桿菌作為花生和番茄自毒物質(zhì)降解菌，對肉桂酸、對羥基苯甲酸、苯甲酸和水楊酸都有較強(qiáng)的降解力，同時(shí)，它具有較強(qiáng)的拮抗能力，對根腐菌和Aspergillusflavus有拮抗作用，這是一種有潛力的生物防治菌。研究顯示，枯草芽孢桿菌是得到國內(nèi)外學(xué)者青睞的一種生防細(xì)菌，并已開發(fā)成相關(guān)生防試劑投放到市場[18]?？莶菅挎邨U菌作為生防菌能夠抑制草莓根腐病菌尖孢鐮刀菌和草莓枯萎病菌[19-20]。

本研究表明，篩選得到一菌株L501枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis，而且其對草莓根系分泌物中的主要有害化感物質(zhì)——苯甲酸有較強(qiáng)的降解作用，并能夠有效拮抗草莓根腐病菌。L501枯草芽孢桿菌系草莓根泌自毒物質(zhì)苯甲酸的降解菌，具有成為草莓根腐病的生防菌潛力，可用于修復(fù)草莓重茬。本研究僅探索該菌株對苯甲酸的降解力，而其對混合酚酸類或其他自毒物質(zhì)的降解能力以及在田間的實(shí)際修復(fù)效果，尚需進(jìn)一步深入研究。